实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

四重荧光定量PCR法鉴定肠炎、鼠伤寒以及伤寒沙门氏菌

目的建立四重荧光定量PCR体系鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。方法针对沙门氏菌属特异性ompC基因、肠炎沙门氏菌sdf基因、鼠伤寒沙门氏菌STM4495和伤寒沙门氏菌STY2021序列设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究。结果 28株不同血清型的沙门氏菌均扩增出ompC基因,其他13株非沙门氏菌均未出现ompC的非特异性扩增。sdf、STM4495、STY2021的探针和引物分别特异性扩增出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌,而25株其他血清型沙门氏菌以及13株非沙门氏菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系的最低检测限分别为48 pg/mL(ompC)、560 pg/mL(sdf)、530 pg/mL(STM4495)、35 pg/mL(STY2021)。结论该方法特异好、灵敏高、能够快速检测沙门氏菌并鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。     

多重PCR技术检测食品中鼠伤寒沙门氏菌3 种毒力基因

该研究建立多重酶链式反应法快速检测鼠伤寒沙门氏菌3 种毒力基因的检测方法。以鼠伤寒沙门氏菌毒力基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB 设计合成特异性引物,提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA 为扩增模板,通过单重聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction,PCR）验证引物特异性,利用引物特异性、Tm 值等综合因素通过多重聚合酶链式反应技术（multiple polymerase chain reaction,MPCR）检测方法实现沙门氏菌多种毒力基因的检测,并优化MPCR 试验参数,提高检测灵敏性。结果表明,在多对特异性引物中进行MPCR 反应,筛选出mgtC、mogA、araB 3 种毒力基因进行MPCR 反应的特异性强、无交叉污染,且该方法能检测的最低灵敏度为0.0165 ng/μL。成功建立快速检测食品中沙门氏菌3 种毒力基因的方法,该方法检测特异性强、灵敏度高,检测限低。     

实时荧光PCR法检测食品中亚利桑那沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）是食品检测过程中最常见的致病菌之一,亚利桑那沙门氏菌（Salmonella arizonae）又是沙门氏菌中比 较难鉴定的亚种。该实验通过实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法快速准确的检测亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌。根据GenBank 公布的亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌gud D基因序列, 分别设计引物和Taqman探针。 使用10株不同血清型的沙门氏菌标准菌 株、88株沙门氏菌分离株和29株食品中常见食源性致病菌进行实时荧光PCR特异性实验。结果显示,该实验所设计的引物探针特异 性非常好。 实时荧光PCR灵敏性试验结果表明,检测灵敏度可达到1～10 CFU/mL的添加浓度。 经模拟污染样品验证,所建立的实时 荧光PCR方法与传统方法的检测结果相一致,具有检测周期短、操作简便的优势。     

3种血清型沙门氏菌多重PCR检测方法的建立

目的建立多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)法检测3种常见血清型沙门氏菌的分析方法。方法以肠炎沙门氏菌Hat基因、鼠伤寒沙门氏菌Stm-4495基因、乙型副伤寒沙门氏菌sdfI基因设计合成特异性引物,提取沙门氏菌基因组DNA为扩增模板,验证引物特异性,优化多重PCR退火温度及引物浓度,检测方法特异性及检出限,并利用该方法对人工污染冷鲜鸡肉进行检测。结果 3对引物特异性强且无交叉影响;25μL多重反应体系中,引物STM、HAT、SDF最佳终浓度分别为:0.5、0.5、0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃;11株阴性对照菌无目标条带检出,方法特异性良好,以3种血清型沙门氏菌纯培养物DNA混合物为模板,检出限低至DNA质量浓度1 pg/μL;人工污染鸡肉经过12 h增菌,能同时检测出3种血清型沙门氏菌的检测限为:肠炎沙门氏菌(4.0±1.0) CFU/g、鼠伤寒沙门氏菌(8.0±0.9) CFU/g、乙型副伤寒沙门氏菌(8.0±0.6) CFU/g。结论本方法特异性强、检测限低,对食品中3种常见血清型沙门氏菌快速检测具有重要意义。     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

S．Heidelberg血清型特异性基因筛选及PCR检测方法的建立与应用

海德尔堡沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Heidelberg,SH)是沙门氏菌属内重要的致病性血清型。通过对SH基因组序列进行BLAST比对和PCR验证,筛选出了4个SH血清型特异性基因(SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3259和SeHA_C3258)。以SeHA_C3258作为靶点设计引物pHAm8(350bp)和沙门氏菌属特异性引物139-141(284bp),建立SH的PCR检测方法,并对其应用效果进行评价。结果表明,经55株不同血清型的沙门氏菌和其他常见食源性致病菌证明,该检测体系具有较好的特异性,纯菌菌落灵敏度为6.1×10~2 CFU/mL。以浓度为N×10~5~N×10~1 CFU/mL的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌为干扰菌时,该体系对10~2 CFU/mL的SH检测结果无影响。人工污染SH的牛奶样品,经8h培养,检测限达1.52CFU/mL。该检测方法能快速、准确检测出食品中的SH,有利于在食品安全领域中的应用。     

IQ-Check Salmonella II Kit方法对食品中沙门氏菌检测的评价

通过对标准菌株和人工污染沙门氏菌的食品样品进行检测,评价IQ-Check Salmonella Ⅱ试剂盒方法。该研究采用试剂盒方法对50株不同血清型的沙门氏菌和50株非沙门氏菌进行检测,分析该方法的灵敏性和特异性;通过对人工污染沙门氏菌食品样品(包括液体奶、婴幼儿配方乳粉、肉及肉类制品)的检测,评价试剂盒方法与GB 4789.4-2016方法的一致性。实验结果表明:当菌浓度在10³ CFU/mL及以上,试剂盒方法对50株沙门氏菌实现全部检出,其对不同血清型沙门氏菌检出限的平均值为6.98×10² CFU/mL。试剂盒方法对50株非沙门检测结果均为阴性,说明试剂盒特异性较好。试剂盒方法与GB方法对人工污染沙门氏菌的食品样品阳性检出率分别为98.77%(161/163)和96.32%(157/163);相对准确度为:96%、99%、97%,总体准确度为97.33%;相对灵敏度为:96.22%、100%、100%,总体灵敏度为98.73%;相对特异性为:95.74%、98.15%、92.86%,总体特异性为95.80%。参照ISO 16140进行方法一致性分析,结果表明两方法在统计学上无显著性差异。该研究表明该试剂盒方法具有高灵敏性和特异性强的特点,在人工染菌食品样品检测中与GB方法呈高度一致性,值得在食品沙门氏菌快速检测中推广应用。     

单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的研制

目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的荧光定量PCR试剂盒.方法:根据本课题组前期工作基础,针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计TaqMan探针和引物,建立荧光定量PCR检测方法,将反应试剂组装成试剂盒,并对该试剂盒的各项参数进行评价.结果:特异性试验表明,组装的试剂盒对8林单核细胞增生李斯特菌标准菌株的检测均呈阳性反应,对6株其它种的李斯特菌及13株食品(环境)中常见的非李斯特污染菌(如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌)呈阴性反应.该试剂盒的基因组DNA检测灵敏度为3.94fg/反应(约合1.34CFU/反应).该试剂盒批内平均变异系数为2.2%,批间变异系数为1.9%,具有良好的重复性;同时稳定性强,反复冻融处理对其无明显影响;可在-20℃下避光保存1年.结论:该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,可应用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测.     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌

为了建立一种含扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,以细菌16S r RNA为扩增内标对照,以沙门氏菌inv A基因为靶基因设计了一对引物,并优化了PCR反应体系。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对沙门氏菌具有良好的特异性。灵敏度实验表明,该检测方法对沙门氏菌纯DNA模板的检测灵敏度为61.1 fg/μL,对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为2×102 cfu/m L。对人工污染蛋清的检测实验显示,沙门氏菌接种量为2 cfu/25 m L的鸡蛋清样品经过8 h增菌培养后,可被该方法检出。结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高,能排除沙门氏菌PCR检测方法中可能出现的假阴性现象,适用于鸡蛋等食品中沙门氏菌的快速检测。     

沙门氏菌血清型快速PCR鉴定方法的建立

通过传统玻片凝集试验对78株沙门氏菌进行血清型检测,结果将这些沙门氏菌分成以鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌为主的21种血清型,其中沙门氏菌SJTUF10023证实为自凝菌,无法鉴定血清型。利用MLST可以较精确地预测、区分不同血清型菌株,聚类的各个分支与血清型基本呈对应关系(96.2%,75/78),其中有3株沙门氏菌(1株阿贡纳、1株阿伯丁和1株斯坦利)聚类结果与血清型不一致。根据O抗原(rfb基因簇)、H1抗原(fli C基因)和H_2抗原(flj B基因)分别设计引物进行PCR反应,并与测序相结合,对78株沙门氏菌进行血清型测定,结果仅1株伤寒沙门氏菌的H_2抗原出现假阳性结果,准确度达98.7%(77/78),且编号为SJTUF10023的自凝菌被鉴定为鼠伤寒沙门氏菌,说明该方法能够准确、快速检测沙门氏菌血清型,有望在沙门氏菌血清型鉴定中成为替代传统血清分型的方法。     

实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌

建立实时荧光PCR检测丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C/Salmonella paratyphi C)和猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis/Salmonella Choleraesuis)的方法。根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌序列,分别设计引物和Taqman探针,使用168株不同血清型的沙门氏菌和21株变形杆菌等非沙门氏菌进行实时荧光PCR检测的特异性试验,可以实现特异性检测丙型副伤寒沙门氏菌,并且可以同时检测丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌。经模拟污染样品检测,灵敏度可达到2～5 cfu/mL的添加浓度。该方法可以快速检测食品中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌。     

基于多重聚合酶链式反应和表面增强拉曼光谱技术的食源性病原菌检测模型的建立与比较

建立基于多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering,SERS)的沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测模型,优化检测方案,提高食源性病原菌检测效率。以病原菌hil A、uid A和clf A的基因序列设计特异性引物,优化多重PCR反应的扩增条件,检测多重PCR的特异性和灵敏性。通过SERS技术检测3种细菌并确定检测限,对3种病原菌进行主成分分析,然后对2种方法的检测限进行比较。结果显示,建立的多重PCR和SERS技术均可特异性地检测出沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,三重PCR反应的最低检测限为104CFU/m L,最低检出DNA量为50 pg/μL,而SERS检测沙门氏菌最低检出量为103CFU/m L,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低检出量为104CFU/m L。PCA分析的前2个主成分的累积贡献率达93. 8%。与多重PCR相比,研究建立的SERS方法提高了沙门氏菌的检测限,敏感度更高,并且缩短了检测时间,对食品中食源性病原菌的监测起到指导作用。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10~0fg/μL,检出限为3.8×10~1CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10~2fg/μL,检出限为3.8×10~3CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。     

免疫捕捉通用引物PCR检测食品中沙门氏菌

利用免疫吸附富集结合经典PCR 技术建立免疫捕捉通用引物PCR(IC-UPPCR)检测食品中沙门氏菌。采用细菌16S rRNA 基因保守区设计特异性引物,建立通用引物PCR 技术是可行的,该IC-UPPCR 检测沙门氏菌的灵敏度最低,能检测到2 × 102CFU/ml,检测沙门氏菌属和非沙门氏菌属标准株的特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。结果表明该方法具有简单、快速、特异性好和敏感性高等特点,并可满足大批样品沙门氏菌筛选检测的要求,适用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_CARB-17和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃ 30 s,引物比例1:1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×102 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。     

胶体金免疫层析法联检食品中5 种典型沙门氏菌模型的建立和优化

采用胶体金标记抗沙门氏菌单克隆抗体,将沙门氏菌单克隆抗体和驴抗鼠抗体（二抗）喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制能联检5 种典型沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌）的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,该试纸条能达到同时检测5 种沙门氏菌的目的,其中甲型副伤寒沙门氏菌的检测灵敏度最高,为105 CFU/mL;鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌的检测灵敏度为106 CFU/mL。沙门氏菌加入量为10～100 CFU时,增菌16～20 h,该试纸条能够检测出牛奶、鸡蛋样本中的5 种沙门氏菌。本实验研制的试纸条能快速高效地联检食品中5 种典型的沙门氏菌,特异性高、灵敏度好,在对多种沙门氏菌进行联检方面有很重要的应用价值。     

速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用

为实现速冻食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重聚合酶链式反应(PCR)检测,首先优化多重PCR扩增的反应条件,比较基因组DNA提取方法,结果表明：退火温度采用60℃、各引物浓度200nmol/L及扩增循环35次,本多重PCR检测技术可以有效地将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检出,检测特异性为100%。3种DNA提取方法中试剂盒法纯度最高,检出限分别是31、26DNA copies/reaction。经过在人工污染致病菌的速冻水饺中应用试验后,该多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检测出起始菌落数低至100CFU/g的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

食源性致病菌快速检测试剂盒的研制与应用

目的:研制1种快速检测沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7和金黄色葡萄球菌的三重PCR检测试剂盒,并加以应用。方法:设计3种待检目的菌特异性引物,优化PCR反应条件,建立多重PCR检测试剂盒,并对其特异性、灵敏度、抗干扰性、准确性等方面进行评估。结果:该试剂盒特异性好,灵敏度高,3种待检目的菌在不同食品介质中的检出限均达到101CFU/mL,抗干扰性强。在6个月保存期内,其稳定性和准确性均未发生改变。结论:本研究建立的试剂盒可同时检测上述3种病原菌,且具有稳定性好、准确性高等特点,可用于禽肉及其制品的日常微生物安全监测。