葡萄EST-SSR标记的开发及其在遗传多样性分析中的应用

为开发高效实用的EST-SSR基因标记,从220 547条葡萄EST序列中共搜索到20 687条至少含有1个SSR位点的EST序列,占EST总数的9.3%。高频率重复类型为一核苷酸、二核苷酸、三核苷酸,占EST-SSR总数的95.7%,其他重复类型仅占4.3%。其中最常见的是一核苷酸重复,其次是二核苷酸重复。从葡萄SSR分析表中筛选出25对EST-SSR引物并对52份葡萄材料进行PCR扩增,结果表明:25对EST-SSR引物在52个葡萄品种中共扩增出条带1033条,其中多态性条带为671条,多态率高达65%。采用NTSYS聚类分析法构建系统树,通过EST-SSR标记对供试品种的聚类分析结果与形态学、生物学分类结果基本一致,说明通过此方法获得的EST-SSR可以作为有效标记用于葡萄遗传多样性分析及遗传图谱构建等。     

大豆EST—SSR标记开发及与Genomic—SSR的比较研究

对458220条大豆EST序列进行SSR搜索,共检测出EST—SSR序列39989条,经拼接得到无冗余EST—SSR序列8190条,包括357种重复基元。其中二、三核苷酸重复基元类型居多,分别占无冗余EST总数的11．13％和16％,统计得到二核苷酸重复类型12种,三核苷酸重复类型60种。以含有简单重复序列的元冗余EST序列设计200对引物,其中148对引物有清晰且单一条带扩增产物,以30份大豆品种资源进行引物筛选,获得多态性引物31对。以21份大豆不同基因型的基因组DNA为模板选取30对显示多态性的大豆EST—SSR引物和30对大豆基因组SSR引物进行扩增,带型统计结果显示：大豆EST—SSR与基因组SSR在供试基因型间多态性指数均值分别为0．55和0．44,二者揭示的多态性水平差异不大。从而说明利用生物信息学方法基于大豆EST开发SSR标记是切实可行的,大豆EST—SSR可以用于大豆遗传多样性分析,是大豆DNA分子标记体系的一个重要补充。     

油棕EST序列中SSR的分布特征分析

为充分利用现有公共数据库中的EST资源开发EST-SSR引物,本研究从GenBank数据库获取39 227条油棕EST,通过聚类拼接和处理,得到全长为7 977.734 kb的无冗余序列15 716条。在这些序列中共检索出699个SSRs,检出率为4.45%,平均11.41 kb出现1个SSR,包括99种重复基元。其中,二核苷酸和三核苷酸重复是主要的类型,分别占总SSRs的38.48%和25.32%。在所有的核苷酸重复基序中,二核苷酸重复序列AG/CT所占比例最高,约占27.47%。Blastx分析发现44.95%的SSR-ESTs与非冗余蛋白质序列数据库（nr）中功能基因同源,功能已知的蛋白质中葡萄来源的SSR-ESTs所占比例最大,为4.42%。同时对54条SSR-ESTs通过GO体系进行功能分类,其中46条能找到同源物,其余8条无同源物,这些序列可划分为18个亚类,在所有功能亚类中,结合活性的功能项和SSR-ESTs数量最多,另外580条未被注释功能信息。     

EST-SSR标记在谷类作物中的通用性研究进展

EST-SSR标记是基于表达序列标签(Express Sequence Tags,EST)开发简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)的一种与功能基因直接相关的新型分子标记技术,因其在不同作物间具有较好的通用性而被广泛应用于作物基因组学研究。不同谷类作物间EST-SSR的通用性可降低引物开发成本、提高效率,为遗传研究较薄弱的作物奠定基础。文章概括介绍了EST-SSR标记,对其在不同谷类作物间及相比较于G-SSR标记的通用性情况进行简单归类分析,评述了EST-SSR标记的不足及其优化措施,以期利用EST-SSR高通用性的特点推动谷类作物基因组学的发展。     

绵羊EST-SSR分子标记的鉴定及特异性分析

通过SSR Finder软件及MISA技术从NCBI系统中的绵羊表达序列标签(EST)数据库中筛查SSR位点,利用Primer 3.0设计绵羊EST-SSR荧光引物,对宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉进行区分。以3种绵羊的肝脏DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行PCR扩增并使用毛细管电泳检测SSR分型。结果显示,通过EST-SSR标记设计的荧光引物p2105.1:248-559、p2025.1:896-1059和p2104.1:704-1015在宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉中具有良好特异性,可实现3个绵羊品种的区分。通过EST-SSR标记技术可准确判断3个纯种绵羊肉的品种,这对绵羊遗传资源的开发利用、品种鉴别以及丰富分子标记类型具有重要的意义。     

绒毛状烟草基因组中SSR位点的信息分析

通过SSRFINDER软件搜索绒毛状烟草基因组DNA,设置条件是重复单元长度2~5 bp,重复次数10～60,共找到6 441个SSR位点,涉及5 227个Scaffold,SSR序列总长为303 963 bp,约占全基因组的0.12‰,即绒毛状烟草基因组中平均每400 kb会出现一个SSR位点。在所有SSR位点中,二、三碱基重复基元分别占总数的45.2%和49.6%,重复单元的重复次数10～20之间的SSR位点占总数的74.6%。     

基于RAD-seq数据开发烟草多态性SSR标记

采用RAD-seq技术对两份烟草材料"118-3"和"粤烟98"进行简化基因组测序,分别获得45 119 346和50 360 738个高质量干净读长（HQ clean reads）。通过序列分析,在22 145个reads覆盖的参考基因组序列中共检测到25 343个SSR位点,其中以二和三核苷酸重复基序最为丰富,占总SSR位点的71.59%;除单核苷酸类型外,SSR基序的重复次数主要集中在4~9之间。根据SSR位点两翼的序列,利用Primer 3.0成功设计出23 346对SSR引物,引物设计的成功率为92.12%。依据测序数据初步发现这些SSR中有323个（1.38%）SSR在两份测序材料间具有多态性,随机选择其中50个SSR在4份烟草材料中进行验证,结果发现在两份测序材料间的多态率为76%,存在24%的假阳性;在另两份烟草材料中多态率为20%。研究结果表明,利用简化基因组测序技术能够开发大量SSR标记和发现样品间具有多态性的SSR标记,可为SSR标记的开发和应用提供基础。     

食用黄花菜SSR标记开发及指纹图谱库构建

利用转录组测序技术开发SSR标记,旨在为食用黄花菜种质资源鉴定、评价及遗传多样性分析提供技术支撑。测序共得到104 177个Unigene,总长度为79 106 833 bp,平均长度为759 bp,利用MISA软件对Unigene进行搜索,共检测到15 890个SSR,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复占比较高,分别为18.57%、27.23%和44.26%。设计合成SSR引物114对,通过聚丙烯酰氨凝胶电泳最终筛选出20对核心引物,20对引物在43份黄花菜种质中共检测到88个等位变异,每个位点的等位变异数为3～8个,平均为4.4个,多态信息含量(polymorphism information content, PIC)值变幅为0.23～0.77,平均为0.499 5。依据扩增产物的片段大小确定了每个SSR位点的等位变异以及对应的参照品种,建立了基于SSR的DNA指纹鉴定技术体系,并构建了43份黄花菜种质的DNA指纹数据。该研究开发的SSR标记具有丰富的多态性。     

基于SSR荧光标记进行酒花品种鉴定

该研究利用SSR(simple sequence repeats,简单重复序列)荧光标记技术构建酒花品种指纹数据库,目的是建立一种快速、准确的酒花品种真实性鉴定技术。TP-M13-SSR是将M13尾巴序列作为通用接头引入SSR正向引物中,仅对M13通用引物进行荧光标记,结合毛细管电泳对不同引物的扩增产物进行检测。该研究从103对候选引物中筛选到多态性丰富、引物组合区分能力最佳的4对引物,在18个酒花品种中共扩增出28个等位基因,每对引物的等位基因数量3～11个不等,平均每对引物产生7. 0个等位基因。通过4对引物可实现18个国内外酒花品种的真实性鉴定,方法快速、准确,可为酒花种植、加工、采购及新品种产权保护方面提供品种真实性鉴定的技术支持。     

辽宁地区绿豆品种SSR指纹图谱构建及品种鉴定

目的：构建辽宁地区绿豆品种的DNA指纹图谱,建立一种快速准确的品种鉴定方法。方法：利用15 对多态性丰富的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）引物构建辽宁地区48?份绿豆品种的指纹数据库及SSR指纹图谱。结果：15?对引物共扩增出58?个等位基因,每对引物检测到2～7?个不等,平均为3.9,其中特异性条带13?个,占总数的22.4%。多态信息含量介于0.114?5～0.776?4之间,平均为0.378?4。选择鉴别能力较强的5?对引物组合,区分率为75%;15?对引物组合,区分率为89.68%。构建了0/1形式的指纹数据库和SSR指纹图谱,除个别品种外均具有唯一性,可用于品种鉴定。结论：SSR指纹图谱的构建为绿豆品种鉴定提供了新的途径,为绿豆资源评价、保护及新品选育提供技术支撑和科学参考。     

绒毛状烟草和林烟草全长cDNA文库构建及EST序列分析

表达序列标签（EST）广泛应用于基因功能研究和分子标记开发。以普通烟草两个二倍体祖先种绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis,TT）和林烟草（Nicotiana sylvestris,SS）多个组织为试验材料,使用CloneMiner cDNA文库构建方法构建了均一化全长cDNA文库,测序并进行序列拼接、功能注释、进化分析和标记开发。绒毛状烟草和林烟草均一化全长cDNA文库容量分别为0.72×10⁶和1.12×10⁶ pfu/mL,重组率分别约为94%和93%,插入片段平均长度为1.4 kb。测序获得20 953条EST序列,拼接为10 504个unigenes。与普通烟草EST序列混合拼接,产生34 450条contigs,123 511条singletons,烟草异源四倍体中T和S基因与绒毛状烟草、林烟草之间的相似性远高于两个二倍体祖先种之间。预测获得104 915个编码序列,其中73 670个序列包含功能结构域,81% unigenes在番茄中具有同源基因。鉴定了11 869个微卫星位点（SSR）和25 209个单核苷酸多态性位点（SNP）。这些数据信息对于烟草基因功能研究和分子育种具有重要价值。     

利用抑制差减杂交分离芝麻耐湿性相关基因

为分离芝麻耐湿性相关基因,以敏感品种鄂芝2号和耐湿品种2541为实验材料,通过抑制差减杂交（SSH）构建了芝麻湿害胁迫的差减cDNA文库。在随机挑取的162个阳性克隆中,测序获得146条高质量的EST,含有106条非重复序列（Unigenes）。其中82条非重复序列与GenBank中的基因或蛋白具有较高的同源性,占全部序列的77.36%。对有功能注释的39条同源序列分析发现,其涉及植物的基础物质、能量代谢、信号转导、转录调控和解毒防御等方面,说明这些基因很可能参与到芝麻的耐湿性反应中。     

可降解咖啡碱的酵母菌菌种筛选及其培养条件的优化

从贵州省毕节市金沙县茶叶种植基地的土壤中分离得到一株可降解咖啡碱的真菌,经表型特征、内转录间隔区序列测定及系统发育树分析鉴定为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)同源菌,命名为Y-1。通过单因素试验及响应面试验设计,以咖啡碱降解率为指标,得到响应面回归模型预测方程,根据预测方程,确定菌株Y-1最优的培养条件为:温度31.00℃,发酵时间46.60 h,咖啡碱添加量0.50 mg/mL、菌种添加量6.90%。在此条件下,利用菌株Y-1在培养基中降解咖啡碱,咖啡碱降解率最高可达(59.39±0.28)。     

利用已知植物R基因对大豆基因组抗病候选基因的预测

用已知的52个抗病基因的全长蛋白质序列在GenBank中对大豆（Glycine max L．）ESTs进行tblastn检索,得到的ESTs具备Score≥100和E—value≤10^-10。作为侯选的抗病基因同源ESTs（R—gene—like ESTs）,利用Phrap软件进行聚类拼接,聚类后的unigene在GenBank数据库中通过Blastx来证实其可能的抗病功能。通过该方法,得到403条与抗病基因同源的ESTs,其中有33个推导编码产物含有NBS—LRR或TIR—NBS—LRR结构域;102条推导的编码产物含有LRR或PK／LRR结构域;254条推导的编码产物含有PK结构域;其它结构域有14条。证明了应用全长序列进行数据库检索的方法是一种快速高效的基因预测方法,得到的RGA数量多类型丰富,为R基因的克隆提供了一种新思路。     

Identification of bottom-fermenting yeast genes expressed during lager beer fermentation

It has been proposed that bottom-fermenting yeast strains of Saccharomyces pastorianus possess at least two types of genomes. Sequences of genes of one genome [S. cerevisiae (Sc)-type] have been found to be highly homologous (more than 90% identity) to S. cerevisiae S288C sequences, while those of the other [Lager (Lg)-type] are less so. To identify and discriminate Lg-type from Sc-type genes expressed during lager beer fermentation, normalized cDNA libraries were constructed and analysed. From approximately 22 000 ESTs, 3892 Sc-type and 2695 Lg-type ORFs were identified. Expression patterns of Sc- and Lg-type genes did not correlate with particular cell functions in KEGG classification system. Moreover, 405 independent clones were isolated that have no significant homology with sequences in the S288C database, suggesting that they include the bottom-fermenting yeast-specific (BFY) genes. Most of BFY genes have significant homology with the S. bayanus genome.     

烟草脱落酸受体基因NtPYR1和NtPYL9的克隆及表达模式分析

为揭示烟草脱落酸(ABA)受体基因NtPYR1和NtPYL9的生物学功能,以拟南芥PYR1和PYL9基因为探针,在NCBI中通过同源比对查找普通烟草表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)序列,将EST序列进行拼接并设计特异性引物,从普通烟草红花大金元c DNA文库中克隆出NtPYR1和NtPYL9基因,其开放阅读框长分别为678 bp和564 bp,分别编码225个和187个氨基酸。NtPYR1和NtPYL9蛋白都具有一个保守的疏水性结构域,同属于PYR/PYL/RCAR ABA受体基因家族,NtPYR1和NtPYL9与番茄同源蛋白的相似性分别达到79.10%和95.24%。遗传聚类分析结果显示:NtPYR1和NtPYL9与番茄和马铃薯同源基因的遗传进化距离最近,说明PYR1和PYL9在茄科植物中较为保守。定量PCR对烟草不同组织表达模式分析表明,NtPYR1和NtPYL9在烟草不同组织中均有表达,分别在子叶和须根中的表达量最高。NtPYR1和NtPYL9表达均受ABA抑制,同时受H₂O₂诱导,说明两基因可能参与烟草的抗逆生理过程。