利用CRISPR/Cas9技术的烟草NtLS基因敲除分析

为了培育无腋芽或少腋芽烟草,基于CRISPR/Cas9系统,对烟草NtLS基因进行靶向基因组编辑,构建了2个特异靶向NtLS基因的CRISPR/Cas9载体cLS1和cLS2,并借助农杆菌介导的烟草转基因技术转化烤烟品种K326,获得20株抗卡那霉素的阳性烟株。10株阳性烟株经过PCR扩增、测序和比对,检测到2株发生蛋白翻译错误的T_0突变烟株。研究结果不仅为腋芽形成的分子机理研究创制了有价值的突变体,而且为培育无腋芽或少腋芽优质烤烟品系提供了遗传材料。     

烟草黄瓜花叶病毒湖北分离物全基因组序列分析及亚组鉴定

为明确我国湖北烟区烟草黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的亚组类型,对湖北地区侵染烟草的CMV HB24株系进行基因组全长克隆和序列分析。结果表明,HB24株系RNA1(GenBank序列号:KC019299)全长为3363个核苷酸(nt),编码993个氨基酸的1a蛋白;RNA2(GenBank序列号:KC019300)全长为3049nt,编码859个氨基酸的2a蛋白和111个氨基酸的2b蛋白;RNA3(GenBank序列号:KC019301)全长为2216nt,编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP蛋白。核苷酸序列同源性分析表明,HB24与Fny,SD和Q株系RNA1同源性分别为91.6%,91.1%和75.9%,RNA2同源性分别为91.8%,97.8%和69.5%,RNA3同源性分别为92.1%,93.4%和73.2%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)ER株系RNA1,RNA2和RNA3的同源性分别为65.5%,56.7%和54.1%,与同属番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)V株系同源性分别为66.9%,57.7%和51.5%。HB24 RNA3 5′NTR(Nontranslated region)的结构分析以及RNA3 5′NTR和CP基因核苷酸序列系统进化树的分析表明,HB24属于CMV亚组IB。     

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。     

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

UPLC-MS/MS法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸

为更加快速准确地测定烟草中的酸性植物激素,通过优化样品的前处理条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定烟草中脱落酸和茉莉酸的方法。结果表明:1脱落酸和茉莉酸的检出限分别为0.082和0.027 ng/m L,加标回收率均在96.4%~110.8%之间,脱落酸的日内和日间相对标准偏差(RSDs)均低于3.86%,茉莉酸的日内和日间RSDs均低于4.53%。2该方法样品用量仅为25 mg;所采用的负离子检测模式选择性高、干扰小。适用于烟草样品中酸性植物激素内源性水平的准确检测。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析

采用RACE技术,从烟叶中克隆了一个新的编码GGPPS蛋白的基因,命名为Ntggpps3,并对其进行了生物信息学分析。Ntggpps3的cDNA序列为1251 bp,包含一个长度为1092 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。NtGGPPS3蛋白与其他植物GGPPSs高度保守。生物信息学预测结果表明,NtGGPPS3的分子量为39.5 kD,等电点为6.28,为亲水性蛋白,N端有叶绿体信号肽。二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,三级结构含有两个富含天冬氨酸的区域,并通过同源建模构建了NtGGPPS3的3D模型。进化分析表明,植物的GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS3属于大亚基。     

烟草绿原酸合成关键基因NtHQT1的克隆及表达分析

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是烟叶中含量最高的多酚类物质,羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(Hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成代谢途径中的关键酶。为研究HQT基因在烟草绿原酸合成中的作用机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个新的HQT基因,命名为Nt HQT1。生物信息学和激素处理后基因表达模式分析结果表明:Nt HQT1 c DNA全长1 305 bp,编码435个氨基酸,Nt HQT1定位在细胞质中,属于疏水性蛋白,其二级结构主要是螺旋和无规则卷曲;茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、生长素(3-Indoleacetic acid,IAA)、独角金内酯类似物(GR24)、细胞分裂素(6-Benzylaminopurin,6-BA)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)能明显上调Nt HQT1基因的表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)对基因表达没有明显作用,预示Nt HQT1基因在烟草生长发育和抗病等生物学过程中发挥重要作用。      

烟草HD-ZIP Ⅳ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析

为了明确NtPDF2在烟草中的生物学功能及其调控腺毛分化发育的作用机制,同源克隆了烟草NtPDF2基因,并对其序列、基因结构、进化关系以及表达模式进行分析。结果表明:NtPDF2 CDS全长为2 199 bp,编码732个氨基酸残基。烟草PDF2蛋白质序列高度保守,尤其是C端序列,均含有3个保守结构域(Homeobox domain,START domain和SAD domain)和1个保守LZ(Leucine zipper)元件。烟草PDF2基因结构高度保守,均由10个外显子和9个内含子组成。进化分析表明,普通烟草NtPDF2基因是由林烟草ML1基因进化而来。表达分析显示,烟草PDF2基因表达具有明显的时空特异性。干旱、黑暗和磷饥饿胁迫可显著下调NtPDF2基因的表达,而盐胁迫对其没有明显影响;NtPDF2基因的表达在赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)和打顶处理条件下均显著上调,这暗示烟草NtPDF2基因参与了调控多种非生物胁迫和激素应答过程。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。