菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质

将菊粉降解菌Paenibacillus sp. Lfos16的菊粉外切酶基因克隆至表达载体p ET-28a (+),转入Escherichia. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。利用镍柱亲和层析纯化重组菊粉外切酶,并进行SDS-PAGE检测。重组菊粉外切酶的表观分子质量为87 k Da,经纯化后,重组菊粉外切酶的比酶活为348.30 U/mg。重组菊粉外切酶作用菊粉和蔗糖的酶活分别为259.37 U/m L和592.16 U/m L,I/S值为0.438,且重组酶水解菊粉的主要产物为果糖。重组菊粉外切酶最适作用温度为40℃,且当温度低于30℃时酶活较稳定;最适作用pH为6。Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)具有显著抑制作用。重组菊粉外切酶对菊粉的K_m为19. 28 mg/m L,Vmax为0.18 mg/(min·m L)。     

木霉LE02 β-1，3-葡聚糖酶酶学特性的研究

对木霉菌株LE02所产β-1,3-葡聚糖酶的酶学特性进行了研究。结果表明,该酶最适反应温度为55℃、最适反应pH值为5.0。Co~(2+)、K+、Zn~(2+)、Li~+、Ba~(2+)、Cu~(2+)以及1.0mmol/L的Fe~(2+)对该酶没有影响,Cd~(2+)和10.0mmol/L的Mg~(2+)对酶具有部分抑制作用,而低浓度的Hg~(2+)、5.0mmol/L以上的Mn~(2+)和10.0 mmol/L的Fe~(3+)能强烈抑制该酶的活性。该酶只能作用于β-1,3-糖苷键,以Larinami为底物时其米氏常数K_m值为128.34μg/mL,最大反应速度V_m为23.01μg/(min·mL)。经过SDS-PAGE测定的分子质量近似为80.137ku。     

库特氏杆菌β-类胡萝卜素降解酶的酶学性质

从库特氏杆菌发酵液中分离出可降解β-类胡萝卜素的酶,经初步纯化,研究其生化性质,为后续研究纯酶性质和应用打基础。以β-胡萝卜素标准品为底物,通过检测其反应最适温度、耐热性、反应最适pH、耐酸性、活化能、米氏常数,最大反应速率等研究该类胡萝卜素降解酶的生化性质。试验结果表明:80℃为最适反应温度,具有较稳定的耐热性。该酶的耐酸性较强,在pH=3.0时活性最高。Fe~(2+)、Mn~(2+),Zn~(2+)抑制酶的活性,Al~(3+)、Fe~(3+),Mg~(2+),Ca~(2+)促进酶活性。由阿伦尼乌斯方程得酶反应的活化能Ea为230.3KJ/mol。在70℃和p H 3.0的条件下,其反应动力学常数Km为4.13 mmol/L,最大反应速率Vmax为1.1842umol/(L·min)。     

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质虾青素β-胡萝卜素角黄质β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al~(3+)和Fe~(3+)是该酶的强效催化剂,Fe~(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。     

谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒p MA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La~(3+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%～17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。     

黑曲霉单宁酶TahA的克隆表达和酶学特性解析

单宁酶在茶饮料和医药等行业的应用受到了许多因素的限制,包括酶学性质研究的缺乏和较高的生产成本等。为此,该研究通过基因工程技术将黑曲霉CICIM F0510的单宁酶基因tah A在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组酶GS115 (pPIC-tahA)。摇瓶水平上,重组菌的单宁酶酶活为1. 04 U/mL。酶学性质的解析表明,重组酶TahA的最适作用温度和pH值分别为30℃和4. 5;分别在20～50℃和pH值3. 5～5. 0孵育1 h和2 h后,TahA的相对酶活仍能保持在60%以上; Cu~(2+)、Mn~(2+)和K~+对重组酶的活性有明显的促进作用,而Co~(2+)、Fe~(3+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Sn~(2+)、EDTA和SDS对其酶活有不同程度的抑制作用;以没食子酸甲酯为底物时,重组酶的Vmax和Km值分别为0. 436μmol/(mL·min)和5. 143 mmol/L。此外,该重组酶还可以水解茶叶提取物中的酯型儿茶素。这些良好的生化特征为重组单宁酶TahA在茶饮料行业中的应用奠定了坚实的基础。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

黑曲霉脂肪酶tglE的基因克隆与生化特征解析

从黑曲霉基因组中克隆了一种新的脂肪酶基因tglE,并在毕赤酵母中成功表达。重组酶具有典型的脂肪酶活性,其最适pH为7. 0,最适温度为40℃;在30～60℃或pH 6. 5～9. 0该酶的酶活力保持在60%以上;在pH 6. 0～8. 0或20～30℃均较为稳定。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、Mg~(2+)和Sn~(2+)对tgl E有明显的激活作用; Fe~(3+)、Zn~(2+)和EDTA对重组酶的酶活抑制作用明显,特别是EDTA可抑制重组酶90%的活。tgl E对橄榄油和C_4底物的作用最强,对棕果油和C16底物的作用最弱。以C_4为底物,tglE的Km值为14. 40 mmol/L,Vmax为46. 72mmol/(m L·h)。tgl E具有催化辛酸和乙醇生成辛酸乙酯的酯化活性。     

大菱鲆鱼皮透明质酸酶的提取及酶学特性研究

以大菱鲆鱼皮为原料,经pH 4.7乙酸-乙酸钠缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、透析后获得鱼皮透明质酸粗酶液,并对其酶学性质进行研究。结果表明,鱼皮透明质酸粗酶的最适pH为6.6,最适反应温度为20℃,在-3℃～45℃具有较高稳定性,浓度为0.15 mol/L的NaCl可使鱼皮透明质酸酶保持较高活性。50 mmol/L的金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+),50 mmol/L的EDTA、L-半胱氨酸和抗坏血酸对鱼皮透明质酸酶均具有抑制作用。双倒数法绘制米氏动力学曲线确定米氏常数K_m为0.094 mg/mL,鱼皮透明质酸酶对不同底物的水解能力依次为:肝素钠透明质酸硫酸软骨素C硫酸软骨素A。在4℃和-18℃条件下贮藏32 d,鱼皮透明质酸酶活性损失分别为79.21%和56.78%。     

米曲霉氨基酰化酶的纯化及粗酶性质研究

利用硫酸铵分级盐析法从米曲霉L-09中提取氨基酰化酶,比活力为56.01 U/mg,纯化倍数为2.06,酶活力回收率为80%。详细研究该粗酶的酶学性质。结果表明,经盐析法提纯的粗酶最适pH为7,最适反应温度为55℃,在55℃下热稳定性良好。溶液中的金属离子对酶活力有很大影响。其中,高浓度的Fe~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对酶活力有抑制作用,低浓度的Co~(2+)离子对酶活力有激活作用。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶曲盘发酵与粗酶性质研究

用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)LW—1进行固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶,其曲盘(大小φ20 cm×4 cm)发酵的最优工艺为:培养基最初料水比为1:1.8,起始pH自然,接种量10%(相对于干物料),曲盘中装料150g(以干料计),通过中间补水和翻曲,32℃培养72 h,最高酶活可达22 250 IU/g(干曲)。对粗酶性质进行研究,结果表明,酶的最适反应温度和pH分别为70℃和3.5,低于60℃、pH5.0～8.0酶稳定,Zn~(2+)、Ca~(2+)、ED- TA对酶有明显的激活作用;Mn~(2+)、Fe~(2+)、pb~(2+)、Sn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Ag~+对酶有一定的抑制作用。     

微波-超声协同提取废弃绿豆种皮中的绿色素

以绿豆芽生产中废弃的绿豆种皮为原料,采用微波-超声波协同提取绿豆种皮色素;通过紫外-可见光谱、高效液相色谱和荧光光谱,初步判定绿豆皮色素的成分;研究了影响绿豆皮色素稳定性因素.结果表明,绿豆皮色素提取的最佳工艺是:乙醇体积分数80%,温度80℃,时间15 min,微波功率30 W,超声协同;初步判定绿豆皮色素的主要显色成分为叶绿素;绿豆皮色素在温度小于80℃、pH=7～9时比较稳定;Fe~(2+)、Fe~(2+)、Al~(3+)等金属离子对绿豆皮色素稳定性影响较大,遇Cu~(2+)、Zn~(2+)离子分别有沉淀生成;随氧化剂的增大,色素吸光度有变小趋势,这可能是氧化剂破坏绿豆皮色素中的不饱和键所致;还原剂对该色素吸光度的影响很小,常用食品添加剂对该色素无太大影响.     

发酵豆酱中蛋白酶高产细菌的筛选及所产蛋白酶的酶学特性研究

从发酵豆酱中分离出四种产蛋白酶细菌,采用Folin-phenol法测定其蛋白酶活力,筛选出产酶活力最强的菌株,并进行酶学特性的研究。结果表明:该酶的最适反应温度为55℃;最适作用pH为8.5;该酶具有较好的稳定性;在pH6.0～8.5条件下稳定;NH+4对该蛋白酶有明显的激活作用,Pb2+、Fe3+则对其表现出强烈的抑制作用;在55℃、pH8.0条件下,该酶解反应的表观米氏常数为0.056%。     

壳聚糖固定化单宁酸酶的特性研究

研究了以壳聚糖为载体交联-吸附单宁酸酶后的化学特性。结果表明：固定化单宁酸酶（简称“ITA”）的最适反应pH为3.0,原酶（简称“TA”）为5．5;ITA最适反应温度为50℃,TA为40℃;ITA的Km（app）为1．3845×10(-1)mol／L,TA为6．7500×10(-5)mol/L;ITA在pH3．0～8．0的范围内残存酶活大于60％,ITA在pH3．0～6.0范围内残存酶活大于60％;ITA在80℃的水浴中保温1h,酶活力仍未见下降,而TA在60℃水浴中保温30min酶已失活;ITA和TA在4℃和30℃的条件下,贮藏20d后,ITA的残存活性大于40％,TA的残存活性小于20％。     

假单胞菌H3壳聚糖酶的纯化及部分酶学性质

对 Pseudmona sp.H3产生的壳聚糖酶粗酶液采用(NH_4)_2SO_4盐析、Sephadex G-25脱盐、Sepharose Q-XL阴离子交换层析和Superdex G-75分子筛层析进行纯化,经SDS-PAGE鉴定为单蛋白带,分子质量约为33.8ku,酶反应最适温度为40℃,最适pH为5.0,降解壳聚精(D.A.90.14％)Km值为3.59g/L,V_(max)值为 3.80mmol/(L·min);Ba~(2+)、K~+、Co~(2+)对该酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Al~(3+)、Cu~(2+)则对酶有抑制作用;此外,该酶除了能降解壳聚糖以外,还具有CMCase活性。     

嗜热真菌单宁酶的克隆表达及在柿子汁中的应用

对嗜热烟曲霉中的单宁酶基因afTanA在毕赤酵母中进行异源表达,分析重组酶的酶学性质及其对柿子汁抗氧化性的影响。研究表明,afTanA基因由1 767 bp碱基组成,编码588个氨基酸和一个终止密码子,存在1个Kex2酶切位点(Lys315-Arg316),其催化活性位点为Ser202、Asp455和His501。重组菌株经48 h诱导,重组AfTanA酶活力达到678U/mL。AfTanA的最适反应温度为40℃,最适pH5.0。不同金属离子浓度对酶活力的影响存在差异,在低浓度(1mmol/L)条件下,Zn2+使AfTanA酶活力提高49.65%,而Cu2+和Fe3+使该酶活力分别降低约78%和98%;在高浓度(5mmol/L)条件下,Zn2+使AfTanA酶活力降低47.12%,Cu2+和Fe3+能够完全抑制AfTanA活性。柿子汁经重组单宁酶AfTanA处理后,其抗氧化性能力显著提高,DPPH、ABTS自由基和·OH清除率分别提高15.79%,12.78%,3.4%。单宁酶AfTanA在毕赤酵母中实现了高效表达,并在果汁加工工业中具有良好的应用潜力。     

富铁酵母培养条件的统计学优化

采用实验室筛选的高铁营养酵母菌为实验菌株,通过统计实验设计的方法对发酵过程进行了优化。首先,在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman设计实验,对影响富铁酵母发酵的氮源、磷源、铁离子浓度、pH、温度和转速等因素进行考察。通过实验,发现温度、振荡速度和Fe~(2+)浓度对富铁酵母的总铁含量的影响较大。利用Box-Behnken设计对此3个主要因素的最佳水平进行了进一步研究,通过二次多项回归方程求解得知在培养温度、振荡速度和Fe~(2+)浓度分别为30.16℃、198.50 r/min和1440.69 mg/L时,总铁含量的最大预测值为594.92 mg/L。     

磁性聚乙烯醇微球固定化β-淀粉酶的研究

磁性聚乙烯醇微球为载体,采用戊二醛交联法固定化β-淀粉酶,并对固定化酶的理化性质等进行了研究。结果表明,磁性固定化β-淀粉酶的总活力、蛋白载量、比活、活性回收率分别为7207.62 U/g,157.21 mg/g,45.85 U/mg和52.38%;固定化β-淀粉酶的反应最适温度和最适pH分别为70℃和5.O;Fe~(2+)和Cu~(2+)对β-淀粉酶有较强的抑制作用,而Zn~(2+)对其有很强的激活作用,Mg~(2+)则不影响β-淀粉酶的活性;β-淀粉酶被固定化后其热稳定性(在水介质中)、操作稳定性、pH稳定性均比自由酶的明显提高。固定化β-淀粉酶在4℃,pH 4.5的缓冲液中保存31 d,其活力仍保持最初活力的98.3%,这比其自由酶的提高26%。     

金属离子对法夫酵母产虾青素影响的研究

为了研究金属离子对法夫酵母产虾青素的影响并优化出有利于法夫酵母产虾青素的金属离子,用单因子实验方法研究不同离子对法夫酵母产虾青素的影响并用正交实验方法对金属离子进行了配比优化。在培养基中添加Zn2+和Mn2+能增加细胞干重,在培养基中添加Zn2+、Fe3+、Mn2+和Cu2+能使培养液中虾青素的浓度增加,在培养基中添加Fe3+和Cu2+能使细胞中虾青素的含量增加。在培养基中添加3μmol/L的Mn2+、1μmol/L的Zn2+、1μmol/L的Fe3+、5μmol/L的Cu2+有利于法夫酵母虾青素的合成,用这些金属离子批式培养法夫酵母,总细胞得率为0.349 g/g(葡萄糖),总虾青素得率为0.266 mg/g(葡萄糖),细胞内虾青素最高含量为0.81 mg/g。