冻干A、C、W_(135)、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～8℃保存的稳定性。方法将冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗放置在2～8℃条件下30个月,定期取样,观察其物理外观,进行鉴别试验,并测定多糖含量、分子大小、水分含量、异常毒性等质量控制指标,评价疫苗质量的稳定性。结果冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗于2～8℃30个月保存,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～8℃保存,其质量稳定。     

高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量

目的采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗中A、C、Y、W135群多糖含量,并对该方法进行验证。方法用三氟乙酸对四价脑膜炎球菌结合疫苗进行水解,得到各群多糖的水解产物:唾液酸、葡萄糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖胺(ManN-6-P),采用HPAEC-PAD法,CarboPac PA10分离柱分别测定缓冲提取液中的总唾液酸、葡萄糖、半乳糖、ManN-6-P的含量,利用归一化的峰面积计算相应唾液酸系数,再计算C群脑膜炎球菌唾液酸含量。对HPAEC-PAD法进行验证,并与传统火箭电泳法检测结果进行比较。结果四价脑膜炎球菌结合疫苗水解后得到的4群单糖均呈良好线性,分离度和峰形均良好;HPAEC-PAD法检测4群糖的日内和中间精密性的RSD均小于5%;各群多糖峰面积的回收率均在80%¹20%之间;3批四价脑膜炎球菌多糖疫苗水解后,经HPAEC-PAD法测定的各群多糖含量与传统火箭电泳法测定结果相当。结论 HPAEC-PAD法检测四价脑膜炎球菌多糖疫苗中的A、C、Y、W135群多糖含量准确、简便、快速、可靠,对控制该疫苗的质量具有重要意义。     

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体(CRM197)特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物(GAMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物(GCMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物(GWMPCRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物(GYMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数(CV)均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。     

不同蛋白载体制备A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性

目的探讨以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)及白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)为载体的A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性。方法将A、C、Y、W_(135)群流脑多糖经溴化氰(CNBr)活化后,以1,6己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为衍生剂制备相应的衍生物,分别与TT及DT在碳二亚胺[N-(3-Dimethylami-nopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]作用下结合,经Sepharose 4FF凝胶层析纯化后,加入冻干保护剂进行冻干,制备成A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗。用两种蛋白载体疫苗分别按1及2.5μg两个剂量(各型多糖的含量为1和2.5μg)免疫小鼠,经腹部皮下注射,于0及14 d各免疫1次,于首次免疫后第28天经静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清各型抗体水平。结果 1及2.5μg两个剂量组的阳转率均高于80%,2.5μg免疫组的阳转率优于1μg免疫组;总体上来说,以TT为蛋白载体结合疫苗的阳转率高于以DT为载体的结合疫苗,对A和W_(135)群脑膜炎球菌多糖结合疫苗较明显。结论以TT及DT为载体制备的A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗均具有良好的免疫原性,TT略优于DT。     

层析法纯化脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖工艺的建立

目的建立一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺。方法将A、C、Y、W135群粗糖样品溶解后,用含2%脱氧胆酸钠(SDC)的Tris-HCl缓冲液稀释,用串联的Capto Adhere和Capto DEAE介质,采用流穿模式,经一步层析将多糖与其他杂质分离,再经Sephodex G25脱盐后获得精糖原液,根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对各型样品的各项指标进行检测。结果 4群多糖均可在柱上流穿,多糖可与蛋白及核酸完全分离;纯化多糖样品的各项指标均符合《欧洲药典》标准,各群多糖的回收率均高于55%。结论建立了一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺,缩短了生产时间,提高了回收率,可替代传统的苯酚抽提工艺,用于脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖的纯化。     

差异火箭免疫电泳定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖方法的建立及验证

目的建立差异火箭免疫电泳(differential rocket immunoelectrophoresis,DRIEP)定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖的方法,并对该方法进行验证。方法制备非均一性抗体琼脂糖凝胶,建立脑膜炎A群、C群、Y群、W135群游离多糖的DRIEP定量检测法,并对该方法的专属性、分离效果、线性、重复性及稳定性进行验证。分别采用DRIEP法及DOC沉淀化学法对11批各群脑膜炎球菌单价结合物进行检测。结果各群多糖抗原只与其相应特异性抗体发生结合,无交叉反应;各群结合物或混合物中的TT可完全与多糖分离;A群、W135群游离多糖定量对照品在2.5~20μg/ml范围内,C群、Y群游离多糖定量对照品在2~10μg/ml范围内,与沉淀峰高度呈良好线性关系,R2均>0.99;各群单价结合物的9次检测结果的CV值均<15%;多价脑膜炎球菌结合疫苗中各群游离多糖含量均比较接近。DRIEP法检测值较DOC沉淀化学法高约1/2倍,但两种方法检测结果的高低趋势具有相似性。结论DRIEP法可用于四价脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖的定量检测,提高了该疫苗的质控水平。     

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的研制A+C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗。方法A群和C群脑膜炎球菌多糖在溴化氰(CNBr)的活化下,以1,6己二酰肼(ADH)作为连接子,与精制破伤风类毒素(TT)在碳二亚胺(EDAC)作用下结合,再按一定的比例将两者混合,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂冻干后,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果经检定,A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗各项指标均达到了质控标准。该疫苗安全性及免疫原性良好。结论已成功研制出冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,该制备工艺是可行的。     

Triton X-114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素

目的采用Triton X-114萃取法去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素。方法1% Triton X-114与多糖溶液在0℃混合均匀,分别加热至25、37和56℃,观察分层情况。离心后收集上层水相,对其中残余萃取剂Triton X-114进行去除方法的选择。比较多糖浓度对萃取的影响及二次萃取的效果,并对终产物进行全面检定。对W135群和Y群脑膜炎球菌多糖进行萃取效果比较。结果最终选择56℃10min作为升温条件,3000r/min离心10min后,上清中多糖的内毒率含量均减少85%以上,多糖回收率不低于80%。残余的Triton X-114选择透析法去除。多糖浓度越低,越易于萃取。二次萃取多糖回收率大于85%。内毒素含量可降低至0.706EU/μg多糖。经检测,终产物多糖的相对分子质量未发生改变,免疫原性与萃取前差异无显著意义,异常毒性、多糖及内毒素含量合格。蛋白含量稍有增加,核酸含量降低。W135群和Y群脑膜炎球菌多糖的萃取结果与A群多糖相似。结论Triton X-114萃取法可以用于去除脑膜炎球菌多糖中的内毒素。     

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定W135群和Y群脑膜炎球菌多糖中半乳糖和葡萄糖含量

目的采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培法(High-performance anion-exchange chromatography with pulsedamperometric detection,HPAEC-PAD)测定W135群和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖中半乳糖和葡萄糖的含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法多糖蛋白结合物原液的混合液经HCl水解处理后,进样CarboPac PA10柱,以氢氧化钠-醋酸钠梯度流洗,脉冲积分安培检测器检测。筛选样品的水解条件;对HPAEC-PAD法进行专属性、精密性及准确性验证,并进行初步应用。结果确定的样品水解条件为以2 mol/L HCl于85℃处理1 h。载体蛋白破伤风类毒素对检测结果无干扰;重复性、日内精密性和不同操作者之间精密性试验结果的RSD均小于5%;准确性试验中葡萄糖和半乳糖的回收率在90%～110%之间。HPAEC-PAD法测定多糖蛋白结合物原液的多糖含量与传统间苯二酚比色法测定结果相当;成品疫苗中的W135群和Y群多糖含量测定结果符合《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》的规定(均≥4μg/剂)。结论 HPAEC-PAD法专属性、精密性和准确性良好,可用于A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗中W135群和Y群多糖含量的测定。     

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中A群游离多糖含量测定方法的建立

目的建立脑膜炎球菌结合疫苗中A群游离多糖含量的定量检测方法,并进行验证。方法采用高效阴离子色谱-电导法(high-performance anion-exchange chromatography with conductivity detection,HPAEC-CD),分析柱:IonPacTMAS11 Analytical(4 mm×250 mm),22 mmol/L Na OH流洗,流速为1 ml/min,25μl自动进样,电导检测。筛选样品的氧化反应最佳温度、双氧水浓度及干烤时间,确定HPAEC-CD的检测限和定量限,并进行专属性、准确性及精密度验证。应用建立的方法检测3批多糖蛋白结合物原液A-破伤风类毒素(A-tetanus toxoid,A-TT)多糖及游离多糖含量,并与《中国药典》三部(2010版)附录ⅦA磷测定法中的传统比色法进行比较;同时检测3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖及游离多糖含量。结果确定样品的氧化条件为:100μl/ml H2O2,220℃干烤90 min。磷标准品在0.1~1μg/ml范围内,峰面积和浓度线性关系良好(r=0.999 877);TT、C-TT、W-TT及Y-TT对测定无干扰;该方法的检测限为0.007μg/ml,定量限为0.024μg/ml;A群脑膜炎球菌多糖原液的加样回收率在97.56%~102.95%之间;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%。A-TT的多糖含量及游离多糖含量与传统比色法测定结果差异较小;3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖含量均符合《A、C群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》及《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》要求,游离多糖含量分别为24.31%、23.04%、24.44%和19.07%、17.80%、19.46%。结论采用H2O2氧化处理,HPAEC-CD检测,除了能对脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中微量A群多糖含量进行定量检测外,还能够进行游离多糖含量的检测。该方法灵敏度和精密度良好,操作简单、安全,对操作者及环境提供了保护。     

Y群脑膜炎球菌多糖活化工艺的优化

目的优化Y群脑膜炎球菌多糖活化工艺,为A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗的研制奠定基础。方法分别以多糖衍化率和游离多糖含量为指标,按照三因素三水平正交试验,以不同的pH值、活化时间和活化剂加量对多糖进行活化后,与破伤风类毒素(TT)偶联,并经Sepharose4FF层析纯化后,对多糖-TT结合物进行各项生化检定、免疫原性检测及稳定性观察,确定最佳活化工艺,并对优化的工艺进行验证。结果以多糖衍化率为指标,可确定pH值和活化剂加量二因素对Y群脑膜炎球菌多糖的活化有显著影响(P<0.05),而以游离多糖为指标时,无法确定三因素对多糖的活化有显著影响(P>0.05),结合各项指标检测及稳定性观察结果 ,确定多糖活化最佳工艺为:在pH12条件下,向每mg多糖中加入等量活化剂,反应10min。采用优化的多糖活化工艺制备3批Y群脑膜炎球菌多糖-TT结合物,各项指标均符合多糖结合疫苗的常规质控标准。结论优化的多糖活化工艺可制备出游离多糖含量低、免疫原性高的Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物,结果具有重复性。     

冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下的稳定性。方法将冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗放置在2~8℃条件下,定期取样,检查其物理外观,检测多糖含量、水分含量和分子大小,并进行鉴别试验以及异常毒性和免疫原性试验,考察其稳定性。结果冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗于2~8℃保存30个月,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下,其质量稳定。     

B群脑膜炎奈瑟菌疫苗的研究进展

随着A、C、W135、Y群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides,Nm)多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的接种使用,相应菌群引起的流行性脑膜炎的发病率和死亡率均得到有效控制,而B群等其他群别引起的流行性脑膜炎发病率有所增加。因B群Nm的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)或多糖-蛋白结合物免疫原性均较低,目前采用常规方法尚未生产出有效的B群Nm疫苗。本文对B群Nm CPS疫苗、外膜囊泡(Out membrane vesicles,OMV)疫苗、脂寡糖(Lipooligosaccharide,LOS)疫苗和重组蛋白疫苗的研究进展作一综述。     

A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗大规模接种后的速发型接种反应观察

目的观察A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗大规模接种后的速发接种反应。方法以A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗为观察组,伤寒Vi多糖疫苗为对照组,按组群随机分层配对的原则,将观察现场分为108个组群,观察组和对照组各分配54个组群进行接种。建立接种反应监测系统,按统一表格和方法对两组的速发接种反应进行监测。结果两组共接种34 543人,其中A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗接种18 167人,伤寒Vi多糖疫苗接种16 376人。A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗速发接种反应率为0.44‰;伤寒Vi多糖疫苗速发接种反应率为0.79‰,二者差异无统计学意义;速发接种反应均出现在接种后15 min内,最早的出现在接种后5 min,速发接种反应中有2例为异常反应,但未出现严重反应。结论A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗速发接种反应发生率低,预后良好。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备

目的制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法经溴化氰(CNBr)分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼(ADH)的连接作用和碳二亚胺(EDAC)的偶联作用下,与破伤风类毒素(Tetanic toxoid,TT)形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT(P<0.01),结合物含量差异无统计学意义(P>0.05)。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。     

脑膜炎球菌W135群多糖含量和分子大小双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis,Nm)多糖疫苗(Groups A,C,Y,W135 menig-nococcal polysaccharide vaccine,MPV4)中W135群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法,并进行初步应用。方法以抗W135群Nm多克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法,采用棋盘滴定法筛选包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度,对W135群Nm多糖进行特异性定量测定,并验证线性关系的重复性;对建立的ELISA法进行特异性、准确度、精密度及定量限的验证;采用建立的ELISA法检测10批W135群Nm多糖样品和10批无关流脑多糖样品,进行W135群Nm多糖的鉴别试验;采用建立的ELISA法测定MPV4多糖含量、多糖分子大小和回收率。结果经棋盘滴定法确定双抗体夹心ELISA法的最佳包被抗体工作浓度为10μg/ml,最佳酶标抗体工作浓度为1∶15 000稀释,W135群Nm多糖在2.5~20 ng/ml浓度范围内剂量反应曲线线性关系良好,相关系数大于0.99。采用建立的双抗体夹心ELISA法检测W135群Nm多糖为强阳性,检测其余样品的结果均为阴性;试验内及试验间测定16、8、4 ng/ml W135群Nm多糖含量的变异系数在1.1%~9.0%之间,回收率在87.5%~105.0%之间,定量限为4 ng/ml;检测W135群Nm多糖的阳性符合率和无关多糖的阴性符合率均为100%。采用该法测定3批MPV4中W135群多糖含量、分子大小及回收率均符合申报MPV4疫苗暂行规程关于W135群Nm多糖的质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4中W135群多糖含量和分子大小的测定。