哈密瓜采后冷藏中主要病原菌的分离鉴定

通过对新疆哈密瓜采后冷藏过程中自然发病的果实进行病原菌的分离筛选,明确引起采后哈密瓜腐烂的主要病原菌的种类。试验采用传统纯培养法、稀释平板涂布法和真菌基因组DNA提取试剂盒法对主要病原菌进行分离筛选及DNA的提取。通过生理生化实验对主要病原菌的生理学特性进行初步研究,并对病原菌的26S rRNA基因的序列进行同源性分析。以NL1和NL4为通用引物进行致病菌的分离鉴定,分离筛选出5株主要病原菌,最终筛选出主要病原菌为镰孢属(Fusarium)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、青霉属(Penicillium)、赤霉属(Gibberella)。其中BJ-M菌株和BJ-M1菌株均属于镰孢属;BJ-M2菌株属于赤霉属;BJ-M3菌株属于葡萄穗霉属;BJ-Q菌株属于青霉属。本研究通过对主要病原菌的分离鉴定为延长哈密瓜的贮藏保鲜期提供理论依据和技术指导。     

贵州黑糯米酒曲优良霉菌分离筛选与鉴定

从贵州黑糯米酒曲中分离筛选出霉菌86株,其中包括根霉属37株、毛霉属35株、青霉属6株、地霉属4株、链格孢属2株、明枝霉属1株以及木霉属1株。采用淀粉平板透明圈法初筛,麸皮培养及黑糯米酿酒实验复筛,得到1株糖化力较强的菌株,编号为Q8-M7。并提取菌株Q8-M7的ITS序列进行分子学鉴定。最终鉴定糖化力较强菌株Q8-M7为米根霉(Rhizopusoryzae)。     

桃果实褐腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其拮抗活性

以桃褐腐菌(Monilinia fructicola)为靶菌,采用稀释分离法和平板对峙法从桃园土壤中筛选出对病原菌有较强拮抗作用的菌株12a和14b。通过离体和活体实验对拮抗菌抑菌活性进行研究,经菌株形态、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定。结果表明:菌株12a和14b分别鉴定为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis),其无菌发酵滤液和挥发性代谢产物对桃褐腐菌的生长有显著的抑制作用,其中12a挥发性代谢产物对其菌丝生长的抑菌效果更为显著(p0.05)。两株拮抗菌的菌液浸泡和熏蒸桃果实,延缓了桃褐腐病发病时间,有效地控制了病斑的扩展。     

湘西腊肉中高产脂肪酶真菌的筛选

为从肉源中筛选高产脂肪酶菌株,本研究以湘西陈年腊肉为样品,采用稀释平板计数法对湘西腊肉中的微生物菌群进行分析,利用产脂肪菌株在罗丹明B和三丁酸甘油酯筛选平板上形成透明圈的方法进行初筛,采用(p-NPP)比色法比较对初筛菌株脂肪酶活力进行复筛,进一步选出并确定样品中高产脂肪酶菌株,并通过形态学和分子生物学相结合的方法鉴定复筛菌株。结果表明:样品湘西陈年腊肉有丰富的微生物群落,是产脂肪酶菌株的良好菌源,其主要微生物群落有酵母菌、霉菌和微球菌;样品腊肉中微生物经罗丹明B和三丁酸甘油酯平板初筛后得M18号菌株,其透明圈最大为2.5cm,C2号菌株次之,透明圈为1.3cm;复筛得酶活力最高的菌株为M18,酶活达11.0U/ml,与初筛结果一致,经构建其16s rDNA区域系统发育树,鉴定M18号目的菌株为草酸青霉。     

TB-DNA平板高效筛选桔青霉核酸酶P1产量突变株

为从大量突变株中快速筛选桔青霉核酸酶P1高产株,建立TB-DNA平板筛选方法,并考察多种因素对TB-DNA平板上核酸酶P1粉红酶解圈形成的影响。在优化反应条件(蒸馏水pH5.8,锌离子1×10-3mol/L、钙离子2.5×10-5mol/L、甲苯胺兰浓度2.5×10-4mol/L及DNA加入0.1%)下,经40℃反应12h,核酸酶P1活力对数值与变色圈直径平方值呈正比关系(R2=0.9965)。不同桔青霉菌株核酸酶P1活力检验结果表明,该方法所得核酸酶活力与传统紫外比色法所得酶活力相比,两组数据线性相关(R2=0.9863,p<0.0001);t-检验及方差分析(one-wayANOVA)结果表明二者不存在显著差异(p<0.05)。TB-DNA平板法可用于核酸酶P1高产菌株的高效筛选。     

流式细胞技术检测酸性饮料中菌落总数的研究

利用流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)检测酸性饮料(pH<4.6)中的菌落总数并与平板法和滤膜法进行比较分析,建立FCM快速检测酸性饮料中菌落总数的方法。选择13种常见实验菌株,通过人工加菌实验进行验证。结果表明,基质和含菌量对FCM法的检测结果影响较大,酸性饮料中的部分菌株难以直接被FCM法检出,需经过滤富集菌于中性TSB肉汤中36 ℃培养22 h排除基质和含菌量低的影响,培养后的菌溶液经FCM法与平板法检测结果均在一个数量级。运用AOAC官方分析方法对酸性饮料中不同浓度13种实验菌株滤膜法和增菌22 h后FCM法的定性检测结果进行统计学分析,卡方值X2<3.84,同时假阴性率=1.9%<2%,假阳性率=4.2%<9.6%,说明FCM法可替代滤膜法进行酸性饮料中菌落总数的定性检测,用于产品的快速放行。     

琼脂块法快速平板初筛米根霉L-乳酸高产菌

以米根霉(Rhizopus oryzae)CS-323为出发菌株,经过紫外线(UV)诱变后,利用溴钾酚绿平板变色圈法及高锰酸钾-溴化钾平板透明圈筛选出18株变异株.基于上述方法,设计琼脂块溴钾酚绿变色圈法及琼脂块高锰酸钾-溴化钾透明圈法,对18株变异株进行进一步筛选,经摇瓶初筛验证,琼脂块透明圈法能准确且迅速的判断菌株产酸大小,并对平板定量初筛检出高产株有较大的意义.     

产细菌素乳酸菌的筛选及其所产细菌素的特性

利用牛津杯双层平板法从豆腐乳中筛选得到一株广谱的、具有较强抑菌活性的乳酸菌菌株,经生理生化分析及16S rDNA基因序列比对确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株发酵液经高温、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、吐温-80、吐温-20、十二烷基磺酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、尿素处理以及在低pH 值(pH＜5)条件下均能够保持较好的抑菌活性,而其发酵产物的抑菌活性受胰蛋白酶和蛋白酶K的影响。抑菌谱实验表明,该菌株的发酵液对部分革兰氏阳性细菌和阴性细菌都有明显的抑制作用,但对酵母菌和霉菌无抑制作用。     

常压室温等离子体诱变选育DHA高产菌株

以野生型裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum SR21)为出发菌株,经过常压室温等离子体(ARTP)诱变,碘乙酸、丙二酸及丙二酸-碘乙酸复合平板筛选,摇瓶发酵及GC定量分析选育DHA高产菌株。结果表明:在功率100 W、气流量10 L/min下,经ARTP诱变15 s,以1. 2 g/L丙二酸作为筛选平板,获得一株诱变菌NA2。摇瓶发酵120 h后,其生物量、油脂总量、DHA产量与原始菌株相比分别提高了18. 11%、14. 87%、46. 12%,DHA产量为6. 59 g/L。经5次传代,性状稳定。     

一株红树林真菌胞外多糖免疫增强作用研究

对分离自海南红树林真菌菌株PH0016的胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)免疫增强活性进行研究.从发酵上清中获取胞外多糖成份,体外实验以外周血单个核细胞刺激增殖实验观察EPS免疫增强活性;将菌株以50 mg/kg剂量连续灌胃小鼠28 d后,对小鼠进行体内免疫功能测定.同时根据形态观察和ITS序列分析对菌株进行鉴定.结果表明,相比于正常对照组,EPS在体外可有效促进外周血单个核细胞增殖(P＜0.05).EPS可有效提高胸脾指数、血清溶血素半数溶血值,增强迟爱型超敏反应及巨噬细胞吞噬功能(P＜0.01).菌株经鉴定为淡紫色拟青霉.从海南红树林分离出一株淡紫色拟青霉,其胞外多糖有较好的免疫调节活性,值得进一步深入研究.     

产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产抗菌物质性质

从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株K2,其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌,特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后,仍然有很强的抗菌活性,并对多种蛋白酶敏感,表明抗菌活性物质为蛋白类物质。通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育分析,鉴定菌株K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。菌株K2 产生的抗菌物质在pH6～9 条件下80℃处理30min 仍保持稳定的抗菌活性,其对敏感菌的作用主要是杀菌,而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。该抗菌物质在菌体生长对数中期产生,在稳定期中期抗菌活性达到最大。     

原桃胶中1株芽孢杆菌的分离鉴定及其主要抗菌物质

从天然原桃胶分离到1 株产抑菌活性物质的芽孢杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。通过硫铵沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH值、温度和3 种蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽孢杆菌TJ12的主要抗菌物质为杆菌肽A。     

芽孢杆菌ZYCHH-01发酵条件优化及其抑菌物质的研究

采用芽孢杆菌ZYCHH-01发酵生产抑菌物质,以大肠杆菌（Escherichia coli）为指示菌株,通过牛津杯法测定其抑菌圈的大小判断其抑菌活性。通过单因素试验结合响应面法研究培养基pH值、发酵温度、接种量以及发酵时间对芽孢杆菌ZYCHH-01浓度和抑菌物质活性的影响。结果表明,最佳发酵条件为接种量3%,发酵温度36 ℃,培养基pH值7.8,发酵时间27.5 h。在此优化条件下,抑菌圈最大直径为21.12 mm。最小抑菌浓度为上清液稀释1∶64。生化试验结果表明,芽孢杆菌ZYCHH-01产抑菌物质对蛋白酶敏感,较耐储存,对有机溶剂和部分表面活性剂稳定,抑菌活性pH范围较大且具有良好的热稳定性,对食源性病菌抑菌活性良好。     

产细菌素屎肠球菌的筛选鉴定及其抑菌特性

从采自四川红原的传统发酵酸乳中分离得到308 株疑似乳酸菌,通过96 孔板法初筛和平板打孔法复筛,筛选出1 株具有明显抑菌作用的菌株SC-Y112。通过形态学观察、16S rDNA序列同源性分析和ropA管家基因序列同源性分析结合生理生化实验,鉴定该菌株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。通过排酸及排除H2O2影响后,该菌株的发酵上清液仍具有明显抑菌活性,经蛋白酶处理后,抑菌效果明显消失或下降,说明发酵上清液中的抑菌成分具有蛋白质性质。进一步探究该菌株所产细菌素的生物学特性、遗传稳定性及抑菌特性表明,该细菌素在菌株接种后6 h产生,12 h达到最高;菌株在连续传代86 代内,产细菌素能力较为稳定;细菌素在 pH 3.0～7.0的条件下稳定,在100 ℃处理30 min后仍具有抑菌活性;SC-Y112所产细菌素具有广谱抗菌性,对单核细胞性李斯特菌有明显的抑菌活性。     

生防菌复配对烟草黑胫病的防治效果研究

为解决单一生防菌防效不稳定问题,通过平板对峙试验、相容试验、盆栽试验从6株生防菌中筛选对烟草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）具有较高拮抗活性的复配菌株组合;利用分子生物学方法对各菌株的16S rRNA和gyrA基因进行系统进化分析,鉴定各菌株分类地位;并采用轮换因子法筛选各菌株的最适发酵培养基。结果表明,GY1、GY10和GY12发酵后混合施用对烟草黑胫病的防治效果最好,平板抑菌率达到86.9%,盆栽防效为74.53%,比GY1、GY10、GY12单独处理分别提高15.34%、27.42%和44.94%;分子鉴定表明,3株菌分别为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;并筛选得到了GY1、GY10、GY12的最适发酵培养基,发酵24 h后生物量相较于基础培养基分别增加了75.12%,92.31%和194.55%。     

高产红曲色素红曲霉菌株的筛选及抑菌试验的研究

用麦芽汁分离培养基从红曲中分离到1株产红曲色素较高的红曲霉S8.研究了S8发酵培养时间对红曲色素及干重的影响,结果表明,当培养时间为72h时,红曲色素及干重均达到最大,分别为158U/mL、0.6657g/L.同时还研究了发酵上清液的抑菌性,结果表明其上清液对指示菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小杆菌、枯草芽孢杆菌)均有较强的抑菌活性.     

红薯淀粉废水中乳酸菌的筛选及其对食源性致病菌的抑制作用

从采集的红薯淀粉废水中分离出3株乳酸菌SPDJ3、SPEJ7 和SPEJ9。通过培养特征、形态特征,生理生化特征及基于16S rDNA序列的系统发育分析的检测,菌株SPDJ3和SPEJ7被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,菌株SPEJ9被鉴定为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。3株乳酸菌发酵上清液对供试8株食源性致病菌均有抑菌作用,菌株SPDJ3对福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）抑制效果较强,抑菌圈直径为（30.37±0.15） mm,菌株SPEJ7和SPEJ9对蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）抑制效果较强,抑菌圈直径分别为（29.43±0.21） mm和（28.27±0.25） mm。     

广谱抑菌性多粘类芽孢杆菌的筛选及其细菌素理化特性

采用热处理和琼脂扩散法从湖泥中筛选出一株产广谱抗菌活性物质的芽孢杆菌XW4,通过形态观察、生理生化实验、16S rDNA分析等对其进行鉴定,并对其发酵产物进行抑菌活性探究。结果表明XW4在细菌发育分类学上鉴定为多粘类芽孢杆菌,其发酵产物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、赖氨酸芽孢杆菌等多种腐败微生物均有抑制作用XW4。XW4无细胞上清液对蛋白酶k敏感,对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感;经60、80、100℃处理30 min后,对大肠杆菌拮抗活性基本不变;在pH3.0~11.0范围内保持其抑菌活性。     

牛类芽孢杆菌BD3526发酵麦麸抑制变形链球菌的特性

研究牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)BD3526抑制变形链球菌(Streptococcus mutans)ATCC35668的特性,拓宽P.bovis BD3526代谢产物的抑菌用途。主要研究P.bovis BD3526在麦麸培养基中的发酵特性和发酵上清液对蛋白水解酶和过氧化氢酶的敏感性、不同pH耐受性和热稳定性,以及对口腔中常见乳杆菌属生长的影响。结果表明,P.bovis BD3526发酵12 h后进入稳定期,在36 h时活性达到4.58×10⁸ CFU/mL、pH值5.20,对Streptococcus mutans ATCC35668抑菌圈直径为(21.27±0.71)mm。该发酵上清液对口腔中常见的有益菌(植物乳杆菌和干酪乳杆菌)无抑菌活性,但对链球菌属微生物抑制作用明显。目标抑菌物质具有良好的热稳定性和pH稳定性、对消化系统蛋白水解酶和过氧化氢酶不敏感;经链霉蛋白酶处理后抑菌活性消失,表明该抑菌物质的化学结构中含有肽类成分。P.bovis BD3526代谢麦麸合成的抑菌物质对S.mutans ATCC35668具有强烈抑制且稳定的抑制效果,这为将来开发特异性功能食品配料或口腔护理产品奠定了理论基础。     

海洋细菌GM-1-1菌株对白色念珠菌的抗菌作用机理初步研究

为了探究生防解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GM-1-1菌株无菌发酵液对白色念珠菌(Candida albicans)的抗菌性质及其抗菌作用机理,采用牛津杯法检测其对白色念珠菌的抑菌效果,通过扫描电镜法、MTT法、分光光度法等测定发酵液对白色念珠菌孢子萌发、细胞形态、生物被膜形成、细胞通透性的影响,初步探讨其抗菌作用机理。结果表明,GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌具有明显的抑制作用,抑菌圈直径达39.5 mm,受抑制的白色念珠菌在不含发酵液的培养基上仍可继续生长;无菌发酵液对白色念珠菌的孢子萌发具有强烈的抑制作用;扫描电镜下发现处理后的白色念珠菌细胞表面凹陷,形态不规则,细胞壁残缺;无菌发酵液抑制了白色念珠菌生物被膜的形成,增加了细胞的通透性。本文初步揭示了GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌的抗菌作用机理,为该菌株的进一步研究和应用奠定基础。