高、低硝态氮营养条件下烟草根系基因表达谱及代谢途径的差异分析

为探索烟草根系对硝酸根信号的响应机制,以烤烟品种K326为材料在温室中(14 h光照,10 h黑暗,温度28℃,相对湿度65%～75%)进行烟苗培养及氮胁迫处理,并利用转录组测序方法研究了烤烟根系在高浓度(硝酸根浓度为5.0 mmol/L)与低浓度(硝酸根浓度为0.1 mmol/L)硝态氮营养条件下分别处理0、6、12和24 h的基因表达差异。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径分析表明,高氮和低氮营养条件下处理6 h时Sub-cluster亚群中一些差异表达基因表达量先上调而后又下降,这些基因主要集中在苯丙素生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等途径中。说明氨基酸、碳氮代谢途径是响应不同氮营养条件的重要代谢途径。而一些参与托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成,嘧啶和嘌呤代谢,果糖和甘露糖代谢,淀粉和蔗糖代谢等多条途径涉及的基因在低浓度氮营养胁迫下呈下降趋势,而在高浓度氮营养胁迫下差异表达基因表达量呈上升趋势,表明低浓度氮营养抑制了烤烟根部生物碱的合成以及能量代谢相关途径的代谢活动,而高浓度氮营养则表现为促进作用。     

烟草叶片在二氯喹啉酸胁迫下的蛋白组学分析

为明确二氯喹啉酸对烟草药害的机理,采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析了二氯喹啉酸处理7 d后烟草畸形叶片较正常叶片的蛋白组学变化。本研究共鉴定出65个差异蛋白,其中表达量上调的23个,下调的42个,它们具有结合、催化和转运等分子功能。分别参与光合作用、防御/抗胁迫、代谢等细胞过程,荧光定量PCR验证结果与蛋白组学数据一致。ABA合成通路中的ABA2及NCED基因能够响应二氯喹啉酸胁迫信号,分别在处理后48和24 h达到表达高峰,处理后72 h下调至较低水平。根据这种上调表达后又迅速下调的基因表达模式,推测烟草体内存在一种应激机制抵抗二氯喹啉酸胁迫。本研究首次在烟草中采用蛋白组学的方法分析二氯喹啉酸胁迫下基因的表达变化,并获得重要候选基因。     

低钾胁迫下过表达NtCaM10对烟草生长及钾素吸收的影响

为探究低钾胁迫下过表达NtCaM10基因对烟草生长及钾素吸收的生理与分子调控机制,以野生型烟草K326(WT)及过表达NtCaM10转基因K326为试验材料,设置两个钾水平,5 mmol/L（常钾）、0.15 mmol/L（低钾）,分析低钾胁迫下NtCaM10基因的表达模式及启动子活性,测定相关生理生化指标、钾离子吸收相关基因的相对表达量及各部位钾含量。结果表明,低钾胁迫后NtCaM10基因的相对表达量显著上升、启动子活性被激活。与常钾水平相比,低钾水平下WT和转基因株系的鲜质量及根系长度均显著降低。在低钾水平下,WT生长受抑制的效果更加明显,NtCaM10过表达3个转基因株系的平均鲜质量相比WT显著提高了57.44%,平均根系长度显著提高了35.77%,转基因系中丙二醛的积累显著低于WT,SOD、POD、CAT的活性均显著高于WT,NtCaM10过表达烟草中的NtHAK1、NtHAK5、NtKC1、NtNKT2的平均相对表达量显著上调,增幅分别为56.60%、81.84%、98.08%、638.89%,过表达NtCaM10烟草根部和地上部的平均钾素积累与WT相比显著提高了21.59%...     

低氮胁迫诱导烟草亲环素基因表达的研究

为研究低氮营养对烟草生长的主要影响,分别在移栽后50d到70d期间测量了低氮胁迫和正常营养条件下烟株中部叶片的叶宽、叶长和50d与60d时的株高,同时应用实时荧光定量PCR方法分析了移栽后50d到70d期间烟草叶片中胁迫响应基因亲环素mRNA的表达量.结果发现低氮营养下叶长、叶宽和株高都小于正常营养条件下的叶片,但是叶长、叶宽平均生长增幅显著大于正常营养下的叶片,而株高的增长幅度则没有明显差异.低氮胁迫下叶片亲环素基因mRNA表达量与正常条件下的基因转录表达量相比有显著增加,最高为正常条件下的6.9倍,并且在移栽后50d到70d期间相对转录水平呈递增趋势.水培实验也证明低氮胁迫可显著诱导叶片亲环索基因的转录表达,诱导表达量达2.0倍之多.结果表明低氮营养胁迫对烟草叶片的生长影响较为显著,且低氮营养可以诱导烟草叶片亲环素基因mRNA表达大量增加,推测低氮营养胁迫下亲环索基因的大量诱导表达可能参与了对烟草叶片生长的调节过程.     

干旱胁迫对转BnDREB1-5烟草碳氮代谢和渗透调节物质的影响

在干旱胁迫后检测了转BnDREB1-5基因烟草碳氮代谢指标和渗透调节物质的变化。结果表明,干旱胁迫后转基因烟草碳代谢指标淀粉酶活性、转化酶活性和可溶性糖含量都明显升高,野生型烟草淀粉酶活性和可溶性糖含量稍微升高,转化酶活性反而降低;转基因烟草氮代谢指标硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量稍微下降,而野生型烟草两者都明显降低;转基因烟叶中有BADH活性,干旱胁迫后BADH活性升高,而野生型烟草中检测不到BADH活性;干旱胁迫后转基因烟叶中脯氨酸含量是野生型的1.08倍。因此,干旱胁迫后转基因烟草碳氮代谢、防御酶活性等方面明显优于野生型。     

烤烟品系LY1306在PEG干旱胁迫下的生理响应及转录组学分析

[目的] 研究烤烟品系LY1306经不同时间干旱胁迫下的生理及基因转录表达的变化,以明确其烟叶应激响应基因表达组学特征。 [方法] 采用15% PEG-6000处理模拟干旱胁迫,分别测定干旱胁迫处理0 h、16 h、24 h后叶片的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性和丙二醛、脯氨酸含量,并用转录组测序的方法对差异表达基因进行GO、KEGG分析。 [结果] LY1306烤烟叶片在15% PEG-6000处理下过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加较快,脯氨酸含量迅速提高。差异基因GO分析表明盐胁迫响应、赤霉素响应等生物过程,以及细胞质核周区和转录因子活性等功能基因在16 h、24 h处理的样品中均表现为上调。KEGG代谢通路分析表明,LY1306烤烟叶片植物激素信号转导途径关键基因在干旱处理后16 h和24 h的处理中均表现为上调。 [结论] 烤烟LY1306品系在15% PEG干旱胁迫下过氧化物酶和超氧化物歧化酶为其抗旱生理表现的主要应激酶类,同时脯氨酸的积累也起到了积极的抗旱作用。赤霉素等植物激素信号转导途径及多种抗旱相关生物过程和代谢通路的基因表达水平上调,是LY1306烤烟品系抵御和适应干旱胁迫的主要途径。      

烟草BELL基因家族鉴定及其温室条件下的表达模式分析

BELL基因是植物中普遍存在的一类基因,其编码的同源异型结构域转录因子参与调控了植物叶片、花序等多个组织的发育过程。为明确烟草BELL基因的结构和功能,通过同源序列比对和功能域分析鉴定了普通烟草BELL基因,结合系统进化和基因表达模式分析对烟草BELL基因的功能进行了初步预测。结果表明,从普通烟草基因组中共鉴定出28个NtBELLs基因,分布于15条不同的染色体上。系统进化分析表明,烟草NtBELLs基因可分为4组,每组参与调控烟草不同的发育过程。NtBELLs基因在6个烟草组织中呈现不同的表达模式,且具有明显的组织特异性。干旱和盐胁迫能显著诱导部分NtBELLs基因的表达,表明该基因家族可能参与了植物抵御非生物胁迫的过程。     

烟草Nt14-3-3基因的克隆及生物信息学和表达模式分析

为明确烟草中Nt14-3-3基因家族的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个14-3-3蛋白基因Nt14-3-3,并进行了生物信息学分析。运用qRT-PCR技术,对该基因非生物胁迫处理烟草幼苗后的表达特性进行了分析。结果显示,该基因序列全长783 bp,编码260个氨基酸残基。Nt14-3-3蛋白是由9个α螺旋组成的球状蛋白,含有32个磷酸化位点。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。Nt14-3-3基因受低钾、高盐、干旱、脱落酸(ABA)、H_2O_2处理的诱导,表明烟草Nt14-3-3基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

烟草幼苗应答低温胁迫的转录组和蛋白质组分析

【背景和目的】低温是烟草育苗过程中遇到的主要逆境之一,对培育适龄健壮的幼苗具有不利影响,为探究烟草应答低温胁迫的分子机理。【方法】将烟草幼苗进行低温胁迫处理不同时间,通过转录组、蛋白组联合分析低温胁迫下的应答事件。【结果】随着低温处理时间的增加,应答低温胁迫的基因数目不断增加。低温处理下,差异表达基因主要富集到与磷酸化、乙烯途径以及光合作用相关的信号通路,而差异表达蛋白也同时富集到与光合作用相关通路。此外,本研究鉴定到5种参与低温应答的多肽,其中低温处理12 h后的Nitab4.5＿0000037g0360多肽在转录组与蛋白组中同时被鉴定到,可能在低温应答过程中起重要作用。【结论】本研究挖掘了烟草幼苗应答低温的基因和蛋白,并为后续挖掘多肽在低温应答过程中的功能提供了理论基础。     

烟草转录因子MYB12基因克隆及表达模式分析

R2R3-MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育和代谢活动中发挥着重要的调节作用。为明确MYB12转录因子在烟草中的生物学功能和调控机制,同源克隆了普通烟草MYB12基因(NtMYB12a和NtMYB12b),利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析对基因功能和调控机制进行了初步预测。结果表明,NtMYB12a和NtMYB12b核苷酸序列一致性为92.91%,氨基酸序列一致性为87.91%。烟草MYB12基因结构高度保守,均由4个外显子和3个内含子组成。进化分析表明,普通烟草中NtMYB12a系由绒毛状烟草MYB12基因进化而来,而NtMYB12b则来源于林烟草。NtMYB12基因表达具有时空特异性,烟草在打顶以及盐、干旱、黑暗和磷饥饿等胁迫处理后,NtMYB12a和NtMYB12b基因表达差异明显,NtMYB12a基因表达水平在打顶处理下呈现上调趋势,在盐、黑暗和磷饥饿胁迫处理下显著下调,而在干旱胁迫下无明显变化;各种胁迫处理均可诱导NtMYB12b基因表达水平的提高,预示着NtMYB12基因在烟草响应各种非生物胁迫中发挥着重要的调控作用。     

低温胁迫下烟苗多酚代谢及其抗氧化能力分析

为了明确在低温胁迫条件下烟苗中多酚物质代谢与抗氧化能力的关系,本研究以烟草K326为材料,对比分析了低温胁迫处理（4℃）和对照处理（25℃）烟苗叶片中多酚物质含量及其代谢酶活性和基因表达水平变化与植物抗氧化酶活性的关系。结果表明,低温胁迫处理后,烟草叶片萎蔫、细胞膜损伤严重,相对电导率升高;总酚含量受低温胁迫影响较小,木质素含量显著增加（p<0.05）;低温处理后,SOD活性显著升高（p<0.05）,CAT活性和总抗氧化能力（T-AOC）均低于对照;PAL、HCT和POD酶活性均升高,PAL、HCT和POD基因表达水平均上调。以上结果表明,低温胁迫促进烟苗多酚代谢中木质素合成,通过提高木质素含量增强细胞壁的保护作用是植物抵御环境胁迫的重要机制。     

光强衰减对烟草叶片碳氮代谢关键基因表达的影响

通过电子显微镜和反转录 PCR方法研究了烟草在遮光处理(分别为 100%, 85%, 70%和 55%的自然光照强度)下烟叶移栽后 78天、85天、105天及 120天(采收当天)四个时期淀粉的积累和淀粉、糖、氮代谢途径关键基因表达量的变化。结果表明,移栽后 105天烟叶生理成熟期之前淀粉含量受光照影响最大,随着光的衰减含量逐渐降低。葡萄糖转化及蔗糖的合成途径中有 4个关键基因表达量随光强减少逐渐降低,且随着烟草的成熟也呈下降趋势。淀粉合成酶基因 GBSSI在叶片扩展期表达较弱,在叶片成熟期大量表达,随着光照强度的减弱表达量稍有减小。氮代谢途径关键基因 Nir、GS等同工酶基因的表达存在一定的互补性,总体基因表达趋势为随光强的减弱表达量逐渐增加,表明在弱光下烟叶氮代谢滞后。      

低钾胁迫下高钾烤烟苗期根系差异表达蛋白分析

为了解高钾烤烟苗期根系在低钾胁迫下的差异表达蛋白及其作用机理,本研究分别提取低钾和正常钾营养液培育的高钾烤烟品系HKDN-5的苗期根系蛋白,酶解后采用液相色谱串联质谱和label-free蛋白定量技术对差异表达蛋白进行鉴定分析。结果表明,与正常钾相比,低钾组共发现681个差异表达蛋白,其中有359个发生下调表达,322个上调表达。差异表达蛋白主要参与脂质代谢、次生代谢、碳水化合物代谢和遗传信息加工等途径。其中,下调蛋白具有翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白相关功能的数量最多,上调蛋白主要为一般功能相关蛋白。差异倍数较大的蛋白主要与代谢和应激反应过程相关。以上结果表明,低钾胁迫产生的差异蛋白主要参与物质代谢及应激反应等相关过程。     

低钾胁迫下钙调素拮抗剂对烟草幼苗钾积累的影响

为探讨低钾胁迫下钙调素（CaM）拮抗剂对植株幼苗钾积累的影响及其生理机制,采用室内水培法,以烟草品种K326为试验材料,设置2个钾水平和2种钙调素拮抗剂（氯丙嗪和三氟拉嗪）处理,分别测定叶片钙离子及钙调素含量、植株各部位钾含量、根系钾离子吸收相关基因的相对表达量、植株生理特征。结果表明,与常钾水平相比,低钾胁迫下植株各部位钾含量、叶片抗氧化酶活性、叶绿素含量及光合特性指标（除水汽压饱和亏外）明显降低。其中,植株地上部及根系钾含量分别显著降低了23.80%和55.50%,根系中NKT2、NtKC1和NtHAK1基因的相对表达量分别增加了4.05、2.98和12.74倍。2个钾水平下,施加钙调素拮抗剂后,植株各部位钾含量、抗氧化酶活性、叶绿素含量及光合特性6项指标（除水汽压饱和亏外）明显降低。低钾胁迫下,与未添加钙调素拮抗剂相比,钙调素拮抗剂处理的叶片钙调素含量、植株各部位钾含量、根系钾吸收相关基因表达量、叶绿素总含量及光合特性6项指标（除水汽压饱和亏外）显著降低,其中植株地上部及根系钾含量平均降低了23.69%和60.00%,根系中NKT2、NtKC1和NtHAK1基因的相对表达量平均降低了82.84%、94.18%和52.44%。低钾胁迫下添加钙调素拮抗剂会抑制钙调素含量,阻碍Ca²⁺-CaM复合体的形成,影响信号传导,导致叶片抗氧化酶活性及光合作用降低,根系中K⁺吸收相关基因的表达量减少,抑制植株K⁺吸收和积累。     

叶面喷施丙三醇对烟叶碳氮代谢及硝酸盐积累的影响

  目的  探索丙三醇对白肋烟碳氮代谢及其硝酸盐积累的调控机理,建立新的白肋烟增效减害调控技术。  方法  以白肋烟品种TN90和TN86为材料,设置不同丙三醇浓度试验,并在确定丙三醇最佳适宜浓度的基础上,设置高氮和低氮两个处理,研究丙三醇对烟叶生物量积累、氮代谢关键酶活性、主要碳氮化合物含量及相关基因表达情况的影响。  结果  1）在高氮和低氮水平下,喷施丙三醇15 d后,烟叶生物量分别增加10.20%和13.36%,氮素积累量和氮素利用效率分别增加10.21%、3.15%、6.81%和3.11%,烟叶总糖和还原糖含量分别升高了25.15%、32.84%、47.76%和44.57%,但7 d后烟叶硝酸盐含量下降了53.22%和59.67%;2）低氮水平下喷施丙三醇烟叶色素、可溶性蛋白质和两糖含量与高氮条件下不喷施丙三醇结果相近;3）基因表达分析表明,喷施丙三醇显著促进了光反应途径、碳固定途径、蔗糖合成和氮代谢途径关键基因的表达,与对照相比,基因CP12-2、PPC16和NPF7.3的表达量增加0.5倍多。  结论  丙三醇能够提高烟叶碳氮代谢能力和氮素利用效率,提高烟叶碳水化合物含量和降低烟叶硝酸盐积累量,减氮配合喷施丙三醇是降低烟叶硝酸盐积累的有效途径。      

烟草DGAT3基因响应冷胁迫应答的功能研究

二脂酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是催化三脂酰甘油（TAG）合成途径的关键酶,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的作用。本研究从普通烟草品种K326中克隆得到NtDGAT3基因,利用荧光定量PCR技术分析不同组织中和低温胁迫下NtDGAT3的表达规律。同时,利用CRISPR/Cas9技术制作NtDGAT3敲除植株,对其耐冷性进行了分析。结果表明,NtDGAT3在烟草根、茎、叶中均有表达,且叶部表达量最高;NtDGAT3受冷胁迫强烈诱导,说明该基因可能对冷胁迫有响应。低温处理试验结果表明,敲除突变体ntdgat3对冷敏感,突变体叶片离子渗漏率及丙二醛含量的变化幅度显著高于野生型烟草;在ntdgat3中,膜脂代谢关键基因PLDα1的表达水平显著高于野生型烟草,而PLDδ的表达水平显著低于野生型烟草。以上结果表明,NtDGAT3基因通过PLDα1和PLDδ的表达参与调节植物低温响应。     

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异蛋白及其生物信息学分析

  目的  探究低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异表达蛋白, 并对其进行生物信息学分析, 为烟草品种选育与栽培调控奠定基础。  方法  分别在低钾和正常钾环境下培育烤烟高钾品系HKDN-5, 提取苗期烟叶总蛋白, 进行酶解, 液相色谱串联质谱和label-free蛋白定量分析。  结果  (1) 与正常钾相比, 低钾胁迫中发现101个差异表达蛋白(差异倍数大于1.5倍), 其中表达下调的有52个, 上调的有49个。(2)差异表达蛋白主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等途径。其中, 上调蛋白具有碳水化合物运输和代谢相关功能的数量最多, 下调蛋白具有翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣蛋白等相关功能的数量最多。  结论  物质代谢和应激反应相关蛋白在低钾胁迫下发生差异表达。      

普通烟草碳酸酐酶家族基因的生物信息学分析

为挖掘普通烟草碳酸酐酶基因的信息并探讨其功能,本研究利用生物信息学方法,在烟草基因组数据库中对普通烟草碳酸酐酶家族成员进行了检索,并对其理化性质、遗传进化、基因结构、蛋白保守基序、顺式作用元件和组织表达模式进行了分析。结果显示,在普通烟草中至少含有9个α和6个β亚家族成员。在进化关系上,不同亚家族成员之间,序列同源性较低;与水稻相比,拟南芥和普通烟草两个亚家族间的亲缘关系较近。亚细胞定位分析结果显示,烟草α亚家族成员在细胞壁、细胞膜、线粒体、叶绿体、细胞质等细胞器中均有分布,而β亚家族成员均存在于叶绿体中。基因结构和保守基序分析说明,各亚家族成员的基因结构和蛋白保守基序呈现较高的一致性。启动子顺式作用元件分析显示,烟草碳酸酐酶基因的启动子中,均含有多个参与光反应、激素响应、非生物胁迫和机械损伤等相关的顺式作用元件。基因组织表达模式分析表明,烟草的碳酸酐酶基因不同成员在不同组织表达水平存在差异,并呈现出时空特异性。本研究结果为烟草碳酸酐酶基因的功能研究奠定了基础。