烟草ACS基因家族鉴定及二氯喹啉酸胁迫条件下的表达分析

二氯喹啉酸药害给烟叶生产造成较大影响。为明确烟草二氯喹啉酸药害的发生机制,对1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因家族进行了鉴定,并对二氯喹啉酸胁迫条件下的基因表达模式进行分析。结果表明,普通烟草共有26个ACS基因。染色体定位分析显示,23个ACS基因定位在染色体上,3个定位在scaffold上。亚细胞定位分析显示,ACS主要定位于细胞核或细胞质中。进化分析表明,ACS蛋白进化形成3个类别。序列比对显示,ACS氨基酸序列含有家族保守结构域和活性位点。启动子分析发现,ACS基因启动子区含有脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素5种激素反应共10种类型的顺式作用元件。表达分析显示,大部分ACS家族成员均受二氯喹啉酸诱导而上调表达。      

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY.序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5'末端和PVY 3'末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区.将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5'端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3'末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响.     

外源dsRNA介导的RNAi对烟草CMV侵染的抑制作用

为研究外源dsRNA介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）对烟草黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）侵染的抑制作用,选择与病毒在寄主体内胞间移动和长距离运输密切相关的移动蛋白（Movement protein, MP）基因为靶标,通过克隆CMV MP基因,结合序列分析评估设计dsRNA,以体外合成的方式制备了MP基因中一段490 bp的dsRNA。通过与CMV共接种,结合MP基因表达水平和病毒发病症状,综合评价MP dsRNA对CMV的抑制效果。结果表明,外源喷施的MP dsRNA显著降低了染病烟株中CMV基因的表达水平,有效抑制了病毒的侵染和危害,具有烟草CMV生物防治的应用潜力。     

初烤烟叶主要外观性状与评吸质量的灰色关联分析

依据全国烟叶质量评价项目2004～2007年烤烟样品的外观质量定量评价和评吸质量评价数据,采用灰色关联分析方法探讨了不同主产区烤烟样品的评吸质量与主要外观性状指标的关联性.结果表明:在当前生产条件下,上部烟叶的色度、叶片结构和油分指标与评吸质量关联度较大,其中最为突出的是色度指标;中部烟叶的色度、身份和油分指标与评吸质量关联度较大,各指标关联程度较均等;下部烟叶的身份、油分和色度指标与评吸质量关联度较大,其中尤为突出的是身份.     

烟草黄瓜花叶病毒湖北分离物全基因组序列分析及亚组鉴定

为明确我国湖北烟区烟草黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的亚组类型,对湖北地区侵染烟草的CMV HB24株系进行基因组全长克隆和序列分析。结果表明,HB24株系RNA1(GenBank序列号:KC019299)全长为3363个核苷酸(nt),编码993个氨基酸的1a蛋白;RNA2(GenBank序列号:KC019300)全长为3049nt,编码859个氨基酸的2a蛋白和111个氨基酸的2b蛋白;RNA3(GenBank序列号:KC019301)全长为2216nt,编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP蛋白。核苷酸序列同源性分析表明,HB24与Fny,SD和Q株系RNA1同源性分别为91.6%,91.1%和75.9%,RNA2同源性分别为91.8%,97.8%和69.5%,RNA3同源性分别为92.1%,93.4%和73.2%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)ER株系RNA1,RNA2和RNA3的同源性分别为65.5%,56.7%和54.1%,与同属番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)V株系同源性分别为66.9%,57.7%和51.5%。HB24 RNA3 5′NTR(Nontranslated region)的结构分析以及RNA3 5′NTR和CP基因核苷酸序列系统进化树的分析表明,HB24属于CMV亚组IB。     

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。     

高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟叶中10种多酚类化合物

为研究烟叶中的植物多酚类化合物,利用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-TQMS)技术,建立了同时分析烟叶中山奈酚(Kaempferol)、花青素(Cyanidin)、氯化飞燕草色素(Delphinidin chloride)、鼠李金(Rhamnazin)、绿原酸(Chlorogenic acid)、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷(Delphinidin 3-O-β-glucopyranoside chloride)、原花青素B2(Procyanidine B2)、氯化花青素鼠李葡糖苷(Keracyanin chloride)、芸香苷(Rutin)和莨菪亭(Scopoletin)等10种植物多酚类化合物质量分数的方法。采用实时离子多反应检测模式,获得10种植物多酚类化合物的特征碎片离子峰,并对烟草花叶病毒(TMV)感染的烟叶样品进行了测定。结果表明:①10种植物多酚类化合物在线性范围内的相关系数(r)为0.999 0～0.999 6,方法的检出限为1～200μg/L,日内精密度(RSD)为0.64%～8.72%,日间精密度(RSD)为1.05%～7.93%;回收率为79.66%～112.74%;②TMV感染极显著(p0.01)增加了烟叶中山奈酚、花青素、氯化飞燕草色素、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷和芸香苷的质量分数,显著(p0.05)降低了烟叶中鼠李金的质量分数,增加了绿原酸的质量分数;③TMV病毒感染对原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭的影响不大,差异不显著。该方法具有良好的灵敏度、精密度和回收率,可用于同时分析植物多酚类化合物。