优化毕赤酵母X33重组表达球形马拉色菌脂肪酶LIP1

研究人工合成球形马拉色菌脂肪酶LIP1的基因,并成功在毕赤酵母X33中重组表达.利用响应面分析法,构建LIP1的酶活回归方程.由响应面分析,在温度27.0℃,pH值为7.69,酵母提取物浓度1.50％和葡萄糖浓度3.37％时,预测最大酶活为33U/mL.通过实验验证,最后结果为38U/mL.该值与模型预测基本一致.优化后的酶活提高了26.67％.通过响应面的条件优化,可以获得毕赤酵母X33重组表达LIP1的最大酶活.     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶I的毕赤酵母多拷贝体系构建及其在高密度发酵中的表达

β-葡萄糖苷酶目前广泛应用于合成烷基糖苷、芳基糖苷和辅助纤维素酶水解纤维素。本研究将来自棘孢曲霉(Aspergilus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶I(ABGL)在毕赤酵母中通过构建多拷贝表达盒的方法实现高效表达,利用同尾酶Bgl II/BamH I反复酶切和用DNA连接酶连接的方法,成功构建了含多拷贝表达盒5’AOX-ABGL-TT的pHKA-(ABGL)3的分泌重组质粒,并线性化重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过七叶苷显色筛选平板筛选获得高表达的GS115/pHKA-(ABGL)3菌株,且在50升发酵罐实现高密度发酵表达。研究表明,以pNPG为水解底物,在甲醇诱导120 h时摇瓶发酵液上清酶活可达83.15 U/mL,较之前报道的酶活提高了3.35倍;同时在50 L发酵罐实现高密度发酵,在甲醇诱导120 h时发酵罐上清酶活可达979 U/mL,较对照菌株的发酵罐上清液酶活提高2.94倍,且总蛋白表达量可以达到12 g/L。     

洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1脂肪酶的异源表达

通过PCR扩增出洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1脂肪酶基因,将基因片段分别克隆到大肠杆菌、毕赤酵母和枯草杆菌的表达载体,转入表达菌株中。结果表明,重组脂肪酶在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,在毕赤酵母中未有表达,而在枯草杆菌中实现了胞外分泌表达,测得发酵上清液酶活为13.8 U/m L。对重组枯草杆菌发酵条件进行了摇瓶初步优化和3 L的反应器分批培养。当以TB为出发培养基,初始p H 6.5,温度为37℃时,在3 L的发酵罐上最终酶活达到34.5 U/m L,是野生菌表达量的4.2倍。     

米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。     

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达和性质鉴定

通过密码子优化改造编码sn-1,3位置专一性疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)基因,同时通过重叠PCR技术合成该基因,并将其克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体p PIC9K中。结果表明,TLL脂肪酶被高效胞外表达,在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液的上清脂肪酶表达量达到0.1 mg/m L,对应的p NPP水解酶活达到312.72U/m L。与对应的原始编码基因重组菌酶活(179.42 U/m L)相比,密码子优化后酶活提高74.29%,表明密码子优化策略成功提高了TLL在巴斯德毕赤酵母中的重组表达。比较毕赤酵母来源的重组TLL与商业化的米曲霉酶学性质发现它们具有相似的最适p H和温度耐受范围。另外,它们在有机溶剂耐受性、表面活性剂和金属离子效应以及位置选择性方面均较为相似,表明毕赤酵母来源的重组TLL同样具有商业化应用的潜力。     

克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。     

抗克伦特罗单链抗体在毕赤酵母GS115中的表达

构建表达抗克伦特罗单链抗体(CBL scFv)的毕赤酵母菌株,筛选高拷贝转化子并诱导CBL scFv在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的含有CBL scFv基因的重组真核表达载体pPICZαA-CBL经BstX I酶切线性化后,利用电转化方法转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性平板筛选高拷贝转化子,以甲醇诱导蛋白表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定及ELISA活性分析。结果显示,通过筛选出的重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为41kDa的蛋白,该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为5.1ng/mL。经检测,重组抗体表达量为0.095g/L。这说明分泌表达CBL scFv的毕赤酵母菌株构建成功,为后期CBL scFv发酵与制备奠定了基础。     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因(ift)与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9 K-IFTase.重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株.该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL.结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达.     

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母SMD1168中的表达

在毕赤酵母SMD1168中利用乙醇氧化酶AOX1强启动子表达黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)。提取黑曲霉Aspergillus niger PCTC的基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增获得葡萄糖氧化酶基因,将目的基因插入到具有AOX1强启动子的表达载体p PICZαA上,经电转化导入毕赤酵母SMD1168中。经zeocin抗性平板初筛、摇床复筛以及SDS-PAGE蛋白质电泳的检测,获得了一株产葡萄糖氧化酶活力的菌株,该株菌在30℃、200 r/min的培养条件下,经体积分数1.0%的甲醇诱导发酵1 d可获得1.12 U/mL的酶活。对该菌株进行了摇瓶产酶条件优化,其最佳发酵条件为:在pH 5、30℃下经体积分数1.5%甲醇诱导7 d,酶活为32 U/mL。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆及在毕赤酵母中的初步表达

采用连续延伸PCR方法克隆到粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）漆酶基因，并将其克隆到表达载体pPIC9k，重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris KM71，部分阳性克隆的PCR结果表明：漆酶基因已整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，重组菌经甲醇诱导后3～5d产漆酶量最高，为2-3U／mL。     

密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb）进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因（tll-opt）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）中碱基GC含量分别由原来的46%提高到49%和42%提高到51%,碱基A、T、C、G均匀分布,减少了AT和GC富集区,利于tll-opt和vhb-opt基因在毕赤酵母X33中的表达。将tll和tll-opt连接到表达载体pPICZαA并转入毕赤酵母X33中。摇瓶培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为7 U/mL和16 U/mL。50 L发酵罐培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为201 U/mL和430 U/mL。为了进一步提高含tll-opt重组工程菌的表达酶活性,将vhb-opt转入该重组工程菌得到工程菌VHb＋（含有tll-opt和vhb-opt）。重组工程菌VHb＋在摇瓶培养条件下最大酶活力为23 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.39 倍和3.28 倍。重组工程菌VHb＋在50 L发酵罐瓶培养条件下最大酶活力为610 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.41 倍和3.03 倍。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。     

RT-qPCR分析拷贝数及mRNA转录水平对表达左聚糖蔗糖酶的影响

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因（SacB）的拷贝数及信使核糖核酸（mRNA）转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平（2.13）为单拷贝菌株（0.42）的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活（13.96 U/mL）较单拷贝菌株（5.48 U/mL）提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1～3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加（P＜0.05）,说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。     

体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶 高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。