抗辐射菌Deinococcus radiodurans DNA修复基因的分子克隆和功能分析(英文)

抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)具有显著的DNA修复能力,包括对丝裂霉素(MC),紫外线(UV)及γ射线引起的DNA损伤的修复。通过化学诱导野生型菌株KD8301而得到的突变体KH3111,对MC,UV及γ射线敏感,对链霉素(Sm)具有抗性。本研究确定了KH3111内发生突变的基因及其核苷酸序列,该基因(orf144b)所编码的蛋白质由284个氨基酸组成,与其它已知的蛋白质不具有同源性,即它是一种新的蛋白质。KD8301和KH3111的orf144b序列只是一个碱基的改变,即由G突变为A,所编码的第149位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸。说明甘氨酸是DNA修复基因orf144b所编码的蛋白质中的一个重要残基。用KD8301的orf144b基因转染KH3111,得到转染体KH3112,其对MC,UV及γ射线都具有同母本(KD8301)一样的抗性。在抗辐射菌中,这种对多种DNA损伤剂产生抗性所需要的基因(orf144b),我们命名为pprA(Pleiotropic gene promoting DNA repair)基因。该基因能在大肠杆菌JM109中高水平表达,并使宿主大肠杆菌产生对MC,UV和γ射线的抗性。在野生型的KD8301中,正常情况下该基因不表达,经MC,UV和γ射线处理KD8301后,可诱导该基因表达。研究表明,PprA蛋白质是一种胞浆蛋白。     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和Pl6蛋白表达的变化

采用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察x射线照射对离体培养的EL-4细胞pi6基因转录及蛋白表达的影响,证实pi6基因转录表达在辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中的重要作用.结果表明,2.0Gy x射线照射后2-48h,EL-4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平.P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12h P16蛋白表达非常显著高于对照组(p＜0.01).剂量-效应实验表明,0.5-6.0Gyx射线照射后12h,EL-4细胞p16mRNA水平明显提高.2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别P＜0.01).研究证实,电离辐射能够诱导EL-4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性.提示辐射诱导pi6基因转录表达增加在辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中发挥重要作用.     

抗辐射球菌pprI基因活体电转染救治小鼠γ射线损伤的实验研究

为研究抗辐射球菌pprI基因活体电转染对哺乳动物急性放射损伤的影响,探讨一种新的救治放射损伤的转基因技术。将自行构建的pCMV-HA-pprI质粒注入接受γ射线照射的小鼠肌肉内,采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,观察照后第1、7、14、28和35天小鼠死亡率、血细胞计数以及骨髓细胞、脾脏和胸腺淋巴细胞凋亡的变化。结果显示,6Gyγ射线可引起小鼠急性致死性放射损伤,转基因组小鼠死亡率(1/10)明显低于单纯照射组小鼠死亡率(4/10)。与单纯照射组和空载体转染组比较,pprI基因转染组小鼠外周血白细胞总数及红细胞总数于照后第7天显著增高(p0.05);血小板数于第7、14天显著增高(p0.05);血淋巴细胞百分率于照后35天恢复正常;pprI基因转染组脾细胞凋亡率于第7、14、28天显著降低(p0.05);胸腺细胞凋亡率于第1、7、14、35天显著降低(p0.05);骨髓细胞凋亡率于第1、7、14和28天显著降低(p0.05),并且胸腺细胞和骨髓细胞凋亡率均于照后28天恢复正常。结果表明,抗辐射菌pprI基因活体电转染对动物急性致死性放射损伤具有明显的防治作用。     

不同剂量γ射线照射诱发CHL细胞基因组不稳定性的研究

采用单细胞凝胶电泳技术和微核检测技术对60Coγ射线照射诱发中国仓鼠肺细胞(CHL细胞)产生的直接效应、基因组不稳定性进行了初步探讨.将对数生长期的细胞分成不同的剂量组,经γ射线照射后,对受照存活细胞进行单细胞凝胶电泳(SCGE)和微核发生率(MF)的测定.同时,将一部分受照存活细胞继续传代培养,待其传至33代时,再给予2 Gy的照射剂量进行二次照射,然后再进行单细胞凝胶电泳和MF的测定.结果表明,首次照射剂量与子代二次照射后的损伤程度存在剂量-效应关系.本实验为探讨辐射诱发基因组不稳定性的研究提供了实验基础.     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和P16蛋白表达的变化

采用RT?PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察X射线照射对离体培养的EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达的影响,证实p16基因转录表达在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中的重要作用。结果表明,2.0GyX射线照射后2—48h,EL?4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平。P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12hP16蛋白表达非常显著高于对照组(p<0.01)。剂量?效应实验表明,0.5—6.0GyX射线照射后12h,?4细胞p16mRNAEL水平明显提高。2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别p<0.01)。研究证实,电离辐射能够诱导EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性。提示辐射诱导p16基因转录表达增加在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中发挥重要作用。     

^60Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用60Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义.用60Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化.结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系.5Gy剂量60Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低.PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要.     

香兰素衍生物VND3207对γ射线照射人淋巴母细胞基因组损伤和凋亡的保护作用

采用单细胞凝胶电泳、微核实验、Annexin Ⅴ标记结合流式细胞术、双荧光染色结合荧光显微镜观察等方法,分别检测不同浓度的VND3207对60Co γ射线照射人淋巴母细胞AHH-1基因组损伤和凋亡的防护作用。中性单细胞凝胶电泳结果显示,5~40μmol/L VND3207能显著减轻2Gy 60Coγ射线照射AHH-1细胞的即刻DNA双链断裂损伤,其表现为与未加药组相比,VND3207保护组细胞的DNA双链断裂损伤(彗星尾矩)显著减小(p<0.01),保护效果随着药物浓度增加更明显。同样,VND3207在5~40μmol/L浓度下,能显著降低0.5Gy、1.0Gy和2.0Gy 60Coγ射线照射AHH-1细胞的微核率,且呈现良好的剂量-效应关系,其中,40μmol/L浓度作用下2.0Gy照射细胞的微核率减少40%。Annexin Ⅴ标记结合流式细胞术和双荧光染色法检测均显示,4.0Gy 60Coγ射线照射AHH-1细胞后8~48h,凋亡发生率随着时间延长而增加,40μmol/L VND3207能显著降低4.0Gy照射诱发的凋亡率及坏死率。本实验结果表明,VND3207对60Co γ射线致细胞基因组损伤和细胞凋亡...     

他莫昔芬联合~(60)Co γ射线辐照下调脑胶质瘤细胞PKCα蛋白表达的实验研究

研究他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)联合Y射线辐照对脑胶质瘤细胞PKCα蛋白表达的影响,初步探讨TAM降低辐射抗性的机制.采用Western-Blot法检测PKCα和G1期调控蛋白CylinD1的表达;碱性单细胞凝胶电泳法检测DNA链断裂.结果提示,TAM联合γ射线辐照可诱导PKCα蛋白和CyclinD1蛋白表达量降低,增加单纯照射对DNA的损伤并抑制其修复.结果提示,TAM联合Y射线辐照能够增强TAM或辐照单独处理对PKCα蛋白表达的下调、诱导CyclinD1低表达和抑制DNA损伤修复,与TAM降低SHG-44细胞的辐射抗性有关.     

整体照射后胸腺细胞和脾细胞p16基因转录和蛋白表达的变化

研究X射线全身照射对小鼠胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达的影响。采用Northern blot检测p16基因转录水平的变化;采用流式细胞术检测蛋白表达的变化。时程结果表明,2.0Gy照射后4-24h,胸腺细胞p16mRNA水平明显增高,8-48h P16蛋白表达显著增高(p<0.05-p<0.01);照射后4-8h脾细胞p16mRNA水平明显增高,24h P16蛋白表达显著增高(p<0.05)。量效结果表明,0.5-6.0Gy照射后,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01);脾细胞p16mRNA水平亦增高,但增幅远低于胸腺细胞,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01)。X射线全身照射可诱导胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达增高。p16表达参与整体照射诱导细胞G1期阻滞的分子调控。     

人扁桃体细胞经γ射线照射后产生淋巴因子能力的变化 Ⅱ.自然杀伤细胞毒因子

人扁桃体淋巴细胞经不同剂量(0～40Gy)γ射线照射并用PHA刺激,在不同培养时间(24～96h)内,以MTT法测其上清液中NKCF活性。结果表明:(1)经2.5～40Gy照射,NKCF活性仅被轻度抑制;(2)经48～96h培养后的上清液中NKCF活性明显高于24h培养后的上清液中的。照射剂量与培养时间对NKCF的产量变化没有交互影响。本文报道的NK细胞抗辐射的结果与文献报道的结果相近,而且被慢性炎症激活的扁桃体NK细胞具有更高的抗辐射能力。     

体外局部大剂量辐射对大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响

介绍了30 Gyγ射线局部照射大鼠股骨头部位,观察辐射对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的影响.辐照2周后取股骨进行骨髓间充质干细胞培养,经细胞诱导液诱导后进行碱性磷酸酶染色,油红O染色,CD31免疫荧光鉴定,同时RT-PCR检测Cbf-α1、PPAR-γ、VEGF-α和KDR的表达.大剂量辐射抑制BMSCs向相关细胞的分化,降低其Cbf-α1、PPAR-γ、VEGF-α和KDR的表达.诱导可促进体外培养BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的分化,照射组Cbf-αl、PPAR-γ、VEGF-α和KDR mRNA水平明显上调,其中PPAR-γ和VEGF-a表达水平接近对照组.体外大剂量辐射抑制BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞分化,给予一定诱导,辐射损伤的BMSCs体外分化能力可以部分恢复,其相关基因的表达恢复明显,但其向成熟成骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞分化的数目依然较少.     

抗辐射菌LexA蛋白对γ射线所致DNA链断裂的影响

观察不同剂量γ射线、不同细胞数量和不同浓度的LexA蛋白对DNA链断裂与修复的影响。结果表明,在2—10Gy范围内,照射剂量与DNA断裂程度之间存在良好的线性关系,r=0.881,当细胞浓度为(OD600=0.4—0.6,相当于2×108细胞/mL),细胞液体积为0.1—0.5mL时,细胞DNA含量与相对荧光强度成正相关,结论抗辐射菌LexA蛋白对γ射线所致细胞DNA链断裂无明显的保护作用。     

辐射对肝癌细胞中乏氧诱导因子-1α的影响及机制研究

研究辐射对肝癌细胞中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）的调控作用。采用氯化钴（CoCl2）化学模拟乏氧，诱导HepG2肝癌细胞内HIF-1α稳定表达，再进行不同剂量的γ射线照射，观察照射后细胞内HIF-1α表达的变化，同时，利用荧光显微镜和流式细胞术（flowcytometry,FCM）对细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量进行检测。结果显示，在乏氧条件下HepG2细胞受1—5Gyy射线照射后，细胞内HIF-1α的表达与辐照剂量呈正相关。在1—3Gyy射线照射后，细胞内活性氧的含量与HIF-1α的表达呈负相关。此研究提示，辐射可增强乏氧细胞内HIF-1α的表达水平，活性氧含量的降低可能与这一调控作用有关。     

基因转染结合局部照射对体内黑色素瘤的抑制作用 :肿瘤的基因—放射治疗策略(英文)

探讨OSM对黑色素瘤体内生长的抑制作用及其在基因 -放射治疗中的应用。将人OSMcDNA插入 pCI-neo构成OSM表达质粒 ( pO) ;Egr- 1基因调控序列 (Egr - 1R)连接于OSMcDNA上游构成辐射诱导性OSM表达质粒 ( pEO)。pO和 pEO转染小鼠B1 6黑色素瘤细胞 ,筛选出OSM表达细胞 ( pO - 1 7和 pEO - 1 ) ,皮下接种C5 7小鼠 ,观察和比较相同生长期内瘤体重量及给予60 Coγ射线局部照射后肿瘤抑制率的变化。结果表明 ;在未照射实验中 ,pO - 1 7和 pEO - 1细胞接种 2 0d后的瘤体重量较对照组明显降低 ;在照射实验中 ,pEO- 1细胞照射后 7d瘤体重量的下降最为显著 ,肿瘤抑制率较未照射时提高 42 3%。说明转基困分泌的OSM可对瘤细胞的体内生长产生抑制 ;γ射线可通过Egr - 1R增强OSM表达的途径 ,加剧对肿瘤的抑制 ,体现出基因 -放射治疗的效果     

γ射线与电磁辐射联合对白血病细胞的作用研究

采用了细胞计数、细胞形态学、流式细胞仪分析方法，用^137Cs照射源，剂量4Gy，磁场强度10MT，频率250Hz照射人早幼粒白血病细胞（HL-60细胞），研究了γ射线与电磁辐射联合对白血病细胞的作用。结果表明，单独γ射线和单独磁场照射均能不同程度地杀伤HL-60细胞，但γ射线与电磁辐射联合作用杀伤HL-60细胞能力更强。电磁场能增加γ射线杀伤HL-60细胞是通过增加γ射线诱导HL-60细胞调亡的发生。     

低剂量γ-射线照射人淋巴母细胞诱导BTG2基因mRNA变化

为观察低剂量γ-射线对人淋巴母细胞AHH1 B细胞转位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)基因m RNA表达水平的影响,探讨BTG2基因作为低剂量范围辐射生物剂量计的可能性,采用0-1.0 Gyγ-射线照射人淋巴母细胞,照射后不同时间点(0-72 h)提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BTG2基因的表达变化,分析该基因的时间-剂量效应关系。结果表明,照射后BTG2基因转录水平表达在低剂量范围呈剂量依赖增加,照射后24 h达峰值,之后逐渐下降,在48 h和72 h时处于平台期,在168 h恢复至初始水平。BTG2基因对低剂量电离辐射敏感,有较好的剂量效应和时间效应关系,具有开发为低剂量辐射生物剂量计的潜力。     

抗辐射菌Deinococcus radiodurans DNA修复基因的分子克隆和功能分析

抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)具有显著的DNA修复能力,包括对丝裂霉素(MC),紫外线(UV)及γ射线引起的DNA损伤的修复。通过化学诱导野生型菌株KD8301而得到的突变体KH3111,对MC,UV及γ射线敏感,对链霉素(Sm)具有抗性。本研究     

60Co γ射线照射人肝癌细胞诱导PIF1基因mRNA变化

分别用2 Gy和4 Gy ⁶⁰Co γ射线照射人肝细胞HepG2,利用real-time PCR方法检测PIF1基因mRNA表达量的变化,以探讨PIF1基因是否参与电离辐射致DNA损伤应答。结果表明,不同剂量的γ射线照射HepG2细胞后,PIF1 mRNA表现出一致的变化规律:即照后先轻微降低随后一直高表达,高表达至少持续到照射后12 h。提示电离辐射能够诱导PIF1表达,表达水平与剂量、时间相关。     

低剂量γ射线对丝裂霉素C损伤小鼠脾细胞的影响

探讨低剂量辐射诱导哺乳动物抗丝裂霉素C(Mitomycin C,MMC)损伤的免疫适应性反应。小鼠接受低剂量γ射线作用后6h,再给予损伤剂量的MMC,然后通过脾细胞计数、流式细胞术、Con A和LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞转化观察小鼠脾细胞数、细胞周期和DNA含量的变化。1mg/kg的MMC(B)组小鼠脾细胞数明显低于正常对照(A)组,50-100mGy照射加MMC(C、D、E)组小鼠脾细胞数明显高于B组。Con A刺激的小鼠脾淋巴细胞转化细胞周期分析表明,D组、E组G0/G1期和S期细胞相对百分率分别显著低于和高于B组。而LPS刺激组,除E组G0/G1期外,D组、E组G0/G1期和S期细胞相对百分率也分别明显低于和高于B组。低剂量γ射线可以诱导MMC损伤小鼠脾细胞数和细胞周期进程的适应性反应。     

X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞的肿瘤坏死因子α(TNFα)表达量的变化

用L929细胞染料摄入法检测了小鼠受不同剂量(75mGy,2.0Gy)X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)表达量的时程变化及全身照射后24h的剂量-效应关系.结果可见,75mGy照射后3h,TNFα表达量有所增加,从6～120h,均显著高于对照组,12h表达量最高;2.0Gy照射后3～120h,不同时间点均显著高于对照,表达量最高点为12h.从剂量-效应关系中可见,经50mGy～2.0Gy不同剂量照射后,TNFα表达量均显著高于对照组,0.5Gy照射组其表达量最高,而经4.0Gy和6.0Gy照射后,TNFα的表达量显著低于对照组.提示一定剂量电离辐射可诱导巨噬细胞产生TNFα.