抗辐射菌Deinococcus radiodurans DNA修复基因的分子克隆和功能分析

抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)具有显著的DNA修复能力,包括对丝裂霉素(MC),紫外线(UV)及γ射线引起的DNA损伤的修复。通过化学诱导野生型菌株KD8301而得到的突变体KH3111,对MC,UV及γ射线敏感,对链霉素(Sm)具有抗性。本研究     

抗辐射菌Deinococcus radiodurans一种新的DNA修复基因pprA的分子克隆测序及特性研究(英文)

抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ具有显著的ＤＮＡ修复能力，包括对丝裂霉素（ＭＣ），紫外线（ＵＶ）及γ射线。通过化学诱导野生型菌株ＫＤ８３０１而得到的突变体ＫＨ３１１１，对ＭＣ，ＵＶ及γ射线敏感，对链霉素（Ｓｍ）具有抗性。ＫＨ３１１１的辐射抗性能够通过转染野生型抗辐射菌ＫＤ８３０１基因组中一个已被克隆的ＤＮＡ片断而得到恢复。转染实验表明，突变体具有很好的自然转化能力，即不缺乏重组修复能力。本研究确定了ＫＨ３１１１内发生突变的基因及其核苷酸序列，该基因（ｏｒｆ１４４ｂ）所编码的蛋白质由２８４个氨基酸组成，与其它已知的蛋白质不具有同源性，即它是一种新的蛋白质。通过ＤＮＡ测序分析，ＫＤ８３０１和ＫＨ３１１１的ｏｒｆ１４４ｂ序列只是一个碱基的改变，即由Ｇ突变为Ａ，所编码的第１４９位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酰胺。说明甘氨酸是ＤＮＡ修复基因ｏｒｆ１４４ｂ所编码的蛋白质中的一个重要残基。用ＫＤ８３０１的ｏｒｆ１４４ｂ基因转染ＫＨ３１１１，得到转染体ＫＨ３１１２，其对ＭＣ，ＵＶ及γ射线都具有同母本（ＫＤ８３０１）一样的抗性。在抗辐射菌中，这种对多种ＤＮＡ损伤剂产生抗性所需要的基因（ｏｒｆ１４４ｂ），我们命名为     

抗辐射菌Deinococcus radiodurans一种新的DNA修复 …

抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ具有显著的ＤＮＡ修复能力，包括对丝裂霉素，紫外线及γ射线，通过化学诱导野生型菌株ＫＤ８３０１而得到的突变体ＫＨ３１１１，对ＭＣ，ＵＶ及γ射线敏感，对链霉素具有抗性，ＫＨ３１１１的辐射抗性能通过传染野生型抗辐射菌ＫＤ８３０１基因组中一个已被克隆的ＤＮＡ片断而得到恢复。     

抗辐射菌Deinococcus radiodurans辐射抗性研究

观察了野生型抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＫＤ８３０１及其修复缺陷突变体ＫＨ３１１１对γ射线的抗性程度,探讨了影响辐射抗性的有关因素。ＫＤ８０３１和ＫＨ３１１１经大剂量γ射线照射（０．５￣１０ｋＧｙ）,制作剂量、存活曲线;利用荧光分光光度法测定细菌的ＤＮＡ含量。结果表明,野生型的ＫＤ８０３１对射线具有显著抗性,推定的ＬＤ９０为９．５ｋＧｙ,而其突变体ＫＨ３１１１的抗性明显     

抗辐射菌lexA基因对受γ射线照射和MMC作用的大肠杆菌敏感性的影响

研究抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌细胞中的表达对其γ射线辐射抗性和丝裂霉素(MMC)敏感性的影响。应用电穿孔技术将携带有抗辐射菌lexA基因的重组质粒PZA172转入大肠杆菌JM109，其启动子为lacZ，用异丙基-硫代-β—D半乳糖苷(IPTG)诱导，(十二烷基磺酸纳)聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳检测LexA蛋白的表达。经受不同剂量γ射线照射和不同浓度的MMC作用，平板菌落计数，绘制存活曲线。抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌细胞中，经IPTG诱导能稳定地表达，lexA基因的显著表达降低了大肠杆菌经γ射线照射和MMC作用后的存活率。抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌中的显著表达降低了大肠杆菌对γ射线和MMC的抗性，其作用机理还有待于进一步的研究。     

~(60)Co γ射线对肿瘤细胞DNA损伤与修复的效应研究

应用碱洗脱法研究了~(60)Coγ射线及其联合高温对L_(5178y)细胞DNA链断裂与修复的影响。结果表明:43℃加温30min能显著抑制γ射线引起DNA断链后的修复,照前比照后加温的增敏效果更好。又应用羟基磷灰石层析法分析得知:HL-60细胞和HL-60(VCR)细胞受照后两者DNA单链断裂程度无显著差异,而DNA断链的修复能力有非常显著的差别,这反映了HL-60(VCR)细胞的重接修复能力强。且细胞的DNA合成功能对γ射线的抗性也较HL-60细胞大,即照后~3H-TdR掺入的受抑制程度低,揭示耐药的白血病细胞对辐射的抗性较大。     

小剂量辐射对淋巴细胞DNA的影响及适应性反应

应用DNA解旋荧光测定(FADU)法,研究了小剂量辐射对淋巴细胞DNA的影响及其诱导的适应性反应。结果表明,FADU法测得的γ射线所致的淋巴细胞DNA断裂与剂量呈线性关系,最小检出剂量为0.3Gy;0.5～8.0cGyγ射线对静止期和丝裂原激活后的淋巴细胞双链DNA百分数无影响;小剂量辐射(2.0cGy)对15Gyγ射线照射所引起的DNA断裂的修复(37℃,15～60min)有促进作用,但对最终修复程度(37℃,120min)无明显提高。小剂量(0.5～4.0cGy)γ射线照射,均可诱导出淋巴细胞对15Gyγ射线所致损伤的抗性,以2.0,4.0cGy的γ射线为诱导适应性反应的最适剂量;大剂量(5～20Gy)的照射均可显现出小剂量(2.0cGy)诱导的适应性反应,以15Gy照射后适应性反应表现最强;3-AB可明显地抑制小剂量辐射诱导的适应性反应。     

小剂量辐射对淋巴细胞DNA的影响及适应性反应

应用DNA解旋荧光测定(FADU)法,研究了小剂量辐射对淋巴细胞DNA的影响及其诱导的适应性反应。结果表明,FADU法测得的γ射线所致的淋巴细胞DNA断裂与剂量 呈线性关系,最小检出剂量为0.3Gy;0.5～8.0cGy γ射线对静止期和丝裂原激活后的淋巴细胞双链DNA百分数无影响;小剂量辐射(2.0 cGy)对15Gy γ射线照射所引起的DNA断裂的修复(37℃,15～60min)有促进作用,但对最终修复程度(37℃,120min)无明显提高。小剂量(0.5～4.0 cGy)γ射线照射,均可诱导出淋巴细胞对15 Gyγ射线所致损伤的抗性,以2.0,4.0 cGy的γ射线为诱导适应性反应的最适剂量;大剂量(5～20 Gy)的照射均可显现出小剂量(2.0 cGy)诱导的适应性反应,以15 Gy照射后适应性反应表现最强;3-AB可明显地抑制小剂量辐射诱导的适应性反应。     

抗辐射菌LexA蛋白对γ射线所致DNA链断裂的影响

观察不同剂量γ射线、不同细胞数量和不同浓度的LexA蛋白对DNA链断裂与修复的影响。结果表明,在2—10Gy范围内,照射剂量与DNA断裂程度之间存在良好的线性关系,r=0.881,当细胞浓度为(OD600=0.4—0.6,相当于2×108细胞/mL),细胞液体积为0.1—0.5mL时,细胞DNA含量与相对荧光强度成正相关,结论抗辐射菌LexA蛋白对γ射线所致细胞DNA链断裂无明显的保护作用。     

他莫昔芬联合~(60)Co γ射线辐照下调脑胶质瘤细胞PKCα蛋白表达的实验研究

研究他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)联合Y射线辐照对脑胶质瘤细胞PKCα蛋白表达的影响,初步探讨TAM降低辐射抗性的机制.采用Western-Blot法检测PKCα和G1期调控蛋白CylinD1的表达;碱性单细胞凝胶电泳法检测DNA链断裂.结果提示,TAM联合γ射线辐照可诱导PKCα蛋白和CyclinD1蛋白表达量降低,增加单纯照射对DNA的损伤并抑制其修复.结果提示,TAM联合Y射线辐照能够增强TAM或辐照单独处理对PKCα蛋白表达的下调、诱导CyclinD1低表达和抑制DNA损伤修复,与TAM降低SHG-44细胞的辐射抗性有关.     

AT细胞特征及纠正细胞基因缺陷的研究

实验证明一株经SV 40病毒转化的毛细血管扩张性共济失调症病人的皮肤成纤维细胞AT 5 BIVA,对电离辐射和博莱霉素高度敏感,对γ射线诱发的DNA合成抑制呈抗性。本文尝试用DNA介导基因转移法向AT细胞导入人基因组DNA或其酶切片段,未能获得稳定的对γ射线抗性的转化细胞。染色体核型分析证实AT 5 BIVA细胞的第11号染色体中的一条缺失或异常。本文对外源目的基因未能稳定植入AT细胞的原因进行了讨论。     

电离辐射对淋巴细胞DNA修复合成的影响

本文用液体闪烁测量法和放射自显影法,测定小鼠及人淋巴细胞在紫外线诱发下的DNA周期外合成(UDS),发现小鼠经γ射线照射后3-4d,其淋巴结和血液的淋巴细胞在UV照射后的UDS明显下降,抑制程度随γ照射剂量增加而加重,二者呈线性依赖关系。两例中度放射病人的外周血淋巴细胞的UDS水平也低于正常。研究结果说明γ射线对细胞修复功能的影响值得重视,UDS测定也可作为辐射敏感指标使用。     

p53基因状态对人卵巢癌细胞辐射敏感性的影响

本研究应用PCR-SSCP银染法检测3株人卵巢癌细胞p53基因的存在状态,以四甲基偶唑蓝（MTT）染色法和流式细胞术（FCM）比较不同p53基因状态的肿瘤细胞在1～10Gy^60Coγ射线照射后的体外生长及凋亡率。结果显示,p53野生型的A2780细胞^60Coγ射线照射后发生明显的生长抑制和凋亡,而p53基因突变型的A2780-CP细胞和缺失型的SKOV3细胞则呈现较强的辐射抗性。本研究结果说明,人卵巢癌细胞的p53基因状态直接影响其对γ射线照射的敏感性。     

~(60)Coγ射线对肿瘤细胞DNA损伤与修复的效应研究

应用碱洗脱法研究了~(60)Co γ射线及其联合高温对L_(5178y)细胞DNA链断裂与修复的影响。结果表明:43℃加温30min能显著抑制γ射线引起DNA断链后的修复,照前比照后加温的增敏效果更好。又应用羟基磷灰石层析法分析得知:HL-60细胞和HL-60(VCR)细胞受照后两者DNA单链断裂程度无显著差异,而DNA断链的修复能力有非常显著的差别,     

电离辐射对人血淋巴细胞的损伤效应

不同剂量~(60)Coγ线、中子及X射线照射正常人血后,以丝裂原PHA、ConA、LPS及PWM诱导血内淋巴细胞体外培养转化实验,研究淋巴细胞亚群的辐射损伤效应。实验用~3H-TdR、~(14)UR及~(14)C-缬氨酸放射性核素标记化合物示踪技术,观察不同丝裂原诱导人血淋巴细胞的增殖分化动态;电离辐射对细胞内DNA、RNA及蛋白质合成的抑制作用,并比较其辐射损伤效应。结果:(1)不同丝裂原诱导的正常人血淋巴细胞增殖分化特性各异,分属不同的淋巴细胞亚群。(2)实验以DNA及蛋白质合成中,放射性同位素参入CPM值为指标,观察到ConA、PHA诱导的T淋巴细胞亚群,其辐射损伤效应大于LPS、PWM诱导的B淋巴细胞。(3)淋巴细胞受中子照射后的损伤效应大于γ射线及X射线照射。(4)不同丝裂原诱导的正常人血淋巴细胞亚群,受照射后其细胞DNA链断裂修复能力愈强,该细胞的辐射敏感性就愈低。     

IDENTIFICATION OF uvrA GENE MUTATION SITES IN TWO MITOMYCIN-SENSITIVE Deinococcus radiodurans STRAINS

抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ具有显著的ＤＮＡ损伤修复能力,包括对丝裂霉素（ＭＣ）,紫外线（ＵＶ）及电离辐射等所致的损伤。在用对ＤＮＡ损伤因子具有抗性的野生型抗辐射菌ＫＤ８３０１的基因组ＤＮＡ构建的基因文库中,有四个克隆能够通过其ＤＮＡ转化,使二株对ＭＣ敏感的Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ的突变体－２６２１和３０２１回复对ＭＣ的抗性。克隆了二株突变体中受突变（ｍｔｃＡ或ｍｔｃＢ）影响的基因,并测定了该基因的核苷酸序列。理论上推定抗辐射菌ｕｖｒＡ基因产物的氨基酸序列是由１０３６个氨基酸组成,与许多细菌的ＵｖｒＡ蛋白质具有同源性。用ＰＣＲ技术扩增二株突变体基因组中相应的ＤＮＡ片段,并对其加以测序分析,确定了突变发生的位点。对于突变体３０２１,其ｕｖｒＡ基因中发生了１４４个碱基对（ｂｐ）的缺失突变（缺失部分包括ｕｖｒＡ的起始密码）,造成了３０２１的ｕｖｒＡ基因的失活。对于２６２１突变体,其ｕｖｒＡ基因内却发生了一个插入突变,造成了该基因的插入失活。该插入序列由１３２２ｂｐ组成,侧面与１９ｂｐ组成的末端反转重复（ＩｎｖｅｒｔｅｄＴｅｒｍｉｎａｌＲｅｐｅａｔｓ,ＩＴＲ）相连接,并产生     

CsI(Tl)探测器对γ射线探测参数的MC模拟

介绍了MC法模拟CsI(Tl)探测器对γ射线探测参数的实验研究。实验采用MC程序包Geant4,分别模拟了Cs I(Tl)探测器探测对不同能量的γ射线点源的探测效率、峰总比和能量分辨率。实验中将模拟值与实测值进行了对比,获得了较好的一致性。实验结果表明:MC法可为Cs I(Tl)探测器性能研究提供参考数据和设计方法。     

辐照环境中盐酸氨溴索注射液的稳定性研究

为考察盐酸氨溴索注射液在辐照环境中的稳定性,将注射液分别经60Coγ射线(吸收剂量2、4、8、16、26、34 k Gy)辐照、光照(4 500±500)lx、紫外线(UV)辐照、高温(40、60℃)处理10 d,以颜色、澄明度、盐酸氨溴索浓度、有关物质为指标,考察其稳定性。结果表明:注射液在γ射线辐照、光照、UV、60℃高温环境中盐酸氨溴索浓度显著下降(p0.01);且注射液经γ射线辐照、UV辐照后降解生成多种极性较大的未知物质,颜色变为红棕色;盐酸氨溴索浓度在各种处理后的储存过程中仍会持续下降。研究结果表明,盐酸氨溴索注射液在γ射线辐照、UV环境中极不稳定,且在两种环境中产生的效应相近。     

N-乙酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸的合成及其抗辐射活性

以L-半胱氨酸为原料,经取代和酰化两步反应合成目标产物N-乙酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸(N-acetyl-S-allyl-L-cysteine,NAc-SAC)。以~(137)Csγ射线照射至不同剂量的ICR小鼠作为研究对象,通过30 d存活率实验、血相和免疫系统实验、各项脏器指数以及外周血淋巴细胞彗星实验,研究目标化合物分别在200、400、600 mg/kg给药剂量下的抗辐射活性。ICR小鼠经伽马射线照射至致死剂量7.5 Gy后,其存活率由单纯照射对照组的41.6%,分别提高到NAc-SAC给药组的58.3%、50.0%和66.7%,平均存活天数明显延长。~(137)Csγ射线照射至亚致死剂量6.0 Gy后,NAc-SAC在不同程度上增加了受照小鼠的脾指数、脾结节数(CFU-S)、骨髓DNA含量和白细胞数。彗星实验中7.0 Gy伽马射线照射联合NAc-SAC给药组小鼠外周血淋巴细胞的尾长、尾矩、Olive尾矩和尾部DNA百分含量明显低于7.0 Gy伽马射线单纯照射组(p0.01),提示NAc-SAC可明显降低辐射导致的DNA损伤。本研究表明,目标化合物NAc-SAC具有一定的抗辐射损伤作用。     

电离辐射对人血淋巴细胞的损伤效应

不同剂量即~(60)Co γ线、中子及X射线照射正常人血后,以丝裂原PHA、ConA、LPS及PWM诱导血内淋巴细胞体外培养转化实验,研究淋巴细胞亚群的辐射损伤效应。实验用~3H-TdR、~(14)C-UR及~(14)C-缬氨酸放射性核素标记化合物示踪技术,观察不同丝裂原诱导人血淋巴细胞的增殖分化动态;电离辐射对细胞内DNA、RNA及蛋白质合成的抑制作用,并比较其辐射损伤效应。结果:(1)不同丝裂原诱导的正常人血淋巴细胞增殖分化特性各异,分属不同的淋巴细胞亚群。(2)实验以DNA及蛋白质合成中,放射性同位素参入CPM值为指标,观察到ConA、PHA诱导的T淋巴细胞亚群,其辐射损伤效应大于LPS、PWM诱导的B淋巴细胞。(3)淋巴细胞受中子照射后的损伤效应大于γ射线及X射线照射。(4)不同丝裂原诱导的正常人血麻巴细胞亚群,受照射后其细胞DNA链断裂修复能力愈强,该细胞的辐射敏感性就愈低。