表达重组谷氨酸脱羧酶工程菌发酵条件的优化

目的对表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,EC4.1.1.15,简称GAD或GDC)的重组大肠杆菌的发酵条件进行优化。方法通过单因素试验优化表达GAD的重组大肠杆菌B3C1的诱导剂IPTG添加时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度,再经响应面分析法优化工程菌的发酵条件(氯化钠、胰化蛋白胨、酵母粉、摇床转速、初始pH值、培养时间、接种量、装液量)。结果工程菌的最佳诱导条件为:IPTG添加时间为工程菌接种后4 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为35℃;工程菌的最佳发酵条件为:酵母粉1.01%,氯化钠0.6%,胰化蛋白胨1.5%,培养时间11.25 h,摇床转速250 r/min,初始pH值6.5,接种量3.0%,装液量11.70 ml。工程菌在该条件下发酵培养,GAD酶活达1 227.33 U,比优化前提高了12.29%。结论已成功对表达GAD的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,为其工业化生产奠定了基础。     

L-谷氨酸氧化酶高密度发酵及催化合成α-酮戊二酸

以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,优化补料策略提高菌体密度,优化诱导策略提高蛋白表达,以高密度发酵所得L-谷氨酸氧化酶(LGOX)全细胞转化L-谷氨酸生产?-酮戊二酸(?-KG).结果表明,摇瓶培养条件下LGOX酶活由IPTG诱导的3.12 U/m L提高到4.78 U/m L;通过指数补料与DO-stat补料相结合的两阶段补料策略,5 L发酵罐中细胞浓度由IPTG诱导的2.49 g/L提高到41.6 g/L,LGOX酶活为59 U/m L.优化诱导策略后细胞浓度为48.4 g/L,LGOX酶活提高到156.1 U/m L,分别是优化前的19.4和50倍,?-KG产量达5160 g/L,提高48倍.     

重组酪氨酸脱羧酶酶学性质

酪氨酸脱羧酶能以L-酪氨酸为底物脱羧生成酪胺。该文利用pET28a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了短乳杆菌来源的酪氨酸脱羧酶,并研究了其酶学性质,考察了起始pH、温度、辅酶、底物浓度等因素对酶活的影响。结果表明,酪氨酸脱羧酶重组表达成功,酶促反应工艺为:在1 mL转化液中含有0.18 g L-酪氨酸,0.02 g湿菌体,0.2 mol/L的醋酸缓冲溶液和0.2 mmol/L的5'-磷酸吡哆醛,40℃,pH=5.5,反应7 h,L-酪氨酸的摩尔转化率达到99%。酪氨酸脱羧酶酶活为29.2 U/g,Km值和Vmax为0.71 mmol/L和9.31mol/(L·min·g)。     

酶法制备D-谷氨酸和γ-氨基丁酸的工艺研究

考察了大肠杆菌AS1．505的L-谷氨酸脱羧酶对L-谷氨酸的专一脱羧作用,分析了转化体系温度、pH值等因素对L-谷氨酸脱羧酶活力的影响。实验结果表明最佳工艺为：温度37℃,转化体系pH值4．8,茵体浓度6g／L,吐温-800．15g／l,菌龄14h,底物浓度50g／L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到15036U。1g湿菌体可重复使用3次共转化DL-谷氨酸25g,其中L-谷氨酸可以完全转化为γ-氨基丁酸。D-谷氨酸及γ-氨基丁酸的总收率可以分别达到理论收率的87％和85％。     

酶法分离制备γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸

以L-谷氨酸(L-G lu)和L-天冬氨酸(L-Asp)两种混合酸性氨基酸〔m(L-G lu)∶m(L-Asp)=1∶1〕为原料,利用大肠杆菌菌体内脱羧酶对L-谷氨酸的专一脱羧作用,酶法分离制备了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。考察了转化体系温度、pH等影响L-谷氨酸脱羧酶活力的主要因素,实验表明,最佳工艺条件为:温度35℃,转化体系pH=5.0,ρ(菌体)=6 g/L,ρ(Tween80)=0.15 g/L,菌龄16 h,ρ(底物)=60 g/L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活高达15 036 U。1 g湿菌体可重复使用3次共转化L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物30 g,其中L-谷氨酸完全转化为γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸的总收率可分别达到理论收率的88%和90%。     

重组真菌腈水解酶的发酵工艺条件及生物催化特性初探【需加急】

对产真菌腈水解酶的重组大肠杆菌的培养基种类、培养基成分、诱导剂种类和浓度、诱导条件、p H和温度进行了系统考察。摇瓶发酵优化结果显示:以甘油作为主要碳源,蛋白胨和酵母膏作为主要氮源,并添加微量元素的SOC培养基作为发酵培养基,最适接种量为0.5%;较优的诱导剂诱导条件为:采用0.5 mmol/L的IPTG诱导12 h,发酵p H=7.5,诱导温度25℃时产酶效果最佳。经过优化后,重组酶的酶活得到了显著提高,总酶活最高达到了3.84 U/m L,相比初始水平(0.84 U/m L)提高约4倍。5 L发酵罐的放大实验表明,产酶效果良好,总酶活和比酶活均与摇瓶水平基本持平。全细胞催化性质考察研究结果表明,该菌株所产腈水解酶催化反应的最适催化反应温度是45℃,最适反应p H约为7.2。     

重组真菌腈水解酶的发酵工艺条件及生物催化特性初探

对产真菌腈水解酶的重组大肠杆菌的培养基种类、培养基成分、诱导剂种类和浓度、诱导条件、p H和温度进行了系统考察。摇瓶发酵优化结果显示:以甘油作为主要碳源,蛋白胨和酵母膏作为主要氮源,并添加微量元素的SOC培养基作为发酵培养基,最适接种量为0.5%;较优的诱导剂诱导条件为:采用0.5 mmol/L的IPTG诱导12 h,发酵p H=7.5,诱导温度25℃时产酶效果最佳。经过优化后,重组酶的酶活得到了显著提高,总酶活最高达到了3.84 U/m L,相比初始水平(0.84 U/m L)提高约4倍。5 L发酵罐的放大实验表明,产酶效果良好,总酶活和比酶活均与摇瓶水平基本持平。全细胞催化性质考察研究结果表明,该菌株所产腈水解酶催化反应的最适催化反应温度是45℃,最适反应p H约为7.2。     

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。     

多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达

生物胺是存在于发酵食品中的一类有机物，过量摄入会危害人体健康。多铜氧化酶中的某些酶具有降解多种生物胺的活性，在减控发酵食品中的氨(胺)类危害物方面具有良好的应用前景。研究多铜氧化酶的分泌表达，对酶的特性改造和工业化生产与应用具有重要意义。本研究通过在解淀粉芽孢杆菌来源的多铜氧化酶N端融合信号肽PhoA实现了多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达，胞外酶活为69.8 U/L。通过优化诱导条件和酶的分泌确定了多铜氧化酶最优发酵条件为诱导温度25℃、IPTG浓度0.05 mmol/L、诱导时菌体OD600=1.0、诱导6 h后添加150 mmol/L甘氨酸；发酵40 h时胞外多铜氧化酶酶活达到238.1 U/L，是优化前的3.4倍。     

谷氨酸脱氢酶发酵工艺的正交试验设计

谷氨酸脱氢酶是谷氨酸生物合成途径中的关键酶。为提高谷氨酸棒杆菌S0615发酵产谷氨酸脱氢酶的酶活,运用正交试验设计对其发酵培养基与培养条件进行了优化研究。结果表明,优化的培养基组成为:尿素0.8%,葡萄糖5%,玉米浆0.8%;优化的培养条件为pH值7.2,温度35℃,搅拌转速350 r/min,通气量1.5 L/min,采用恒定pH值控制尿素流加。在此发酵工艺条件下,谷氨酸脱氢酶的酶活可达到35.87 U/g。     

重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺,为其规模化生产奠定基础。方法以目的蛋白的表达量及菌体浓度作为综合评价指标,对重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的摇瓶发酵温度、初始pH值、溶解氧、IPTG浓度及诱导时间进行优化;以摇瓶发酵结果为基础,进一步对发酵罐培养工艺中诱导时机、诱导时间及补料培养基配方进行优化;以确定的罐发酵工艺条件连续发酵5批,验证该发酵工艺。结果最适摇瓶发酵工艺条件为:发酵温度为37℃,初始pH值为7.0,高溶氧,IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为4 h;最适罐发酵工艺条件为:菌体A600值约为40时开始诱导,诱导时间为4 h,补料培养基配方为葡萄糖25%,MgSO4.7H2O 0.5%。按照确定的工艺连续发酵5批,最终菌体A600均达50.0以上,目的蛋白的表达量均高于15%。结论优化的重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺稳定性良好,已达到中试生产规模的要求。     

复杂MeSO4体系初步除杂和深度净化

分别以浸出液和氟化沉淀液为原料,采用单因素法对复杂MeSO4体系氟化沉淀除钙镁和复盐沉淀深度净化进行了研究. 氟化沉淀除钙镁实验结果表明,在温度90℃、时间1.0 h、pH 3.5及NH4F用量为理论量2.0倍的优化条件下,Ca2+和Mg2+的平均去除率分别为92.98%和89.95%. 复盐沉淀深度净化实验结果表明,硫酸铵的浓度和溶液酸度是复盐沉淀深度除Si的关键,优化条件为pH=1.5~2.5、游离硫酸铵浓度2.0~2.5 mol/L、时间1.0~1.5 h和室温. 在此条件下,Fe, Mn和Zn三种主体成分的沉淀率分别是69.94%, 86.52%和96.88%,Si的去除率为54.85%.     

重组人角质化细胞生长因子-2发酵条件的优化及其活性

目的优化重组人角质化细胞生长因子-2(Recombinant human keratinocyte growth factor-2,rhKGF-2)基因工程菌的发酵条件,并对rhKGF-2进行纯化及活性检测。方法优化rhKGF-2基因工程菌接种量、装液量、培养基初始pH值、IPTG浓度、诱导时机和诱导时间等发酵条件;rhKGF-2经离子交换层析和肝素亲和层析后,采用MTT法检测其对NIH-3T3细胞增殖的影响。结果 rhKGF-2基因工程菌的最佳发酵条件为:接种量2.0%,装液量50ml/250ml三角瓶,培养基初始pH值6.5～7.0,IPTG浓度0.10mmol/L,菌体处于对数生长初期时(A600=0.8～1.0)开始诱导,诱导时间4h;纯化的rhKGF-2经HPLC检测纯度达95.0%以上;在1～100μg/ml浓度范围内,rhKGF-2对NIH-3T3细胞的增殖具有促进作用。结论优化了rhKGF-2基因工程菌的发酵条件,获得了纯度较高、具有活性的rhKGF-2蛋白,为其工业化生产奠定了基础。     

铁氧体法处理含镍废水的工艺条件研究

实验研究了铁氧体法处理含镍废水的工艺条件。在pH=8.0～9.0,Fe2+∶Ni2+(废水中两种离子浓度比)=14,温度30～40℃的条件下,镍离子能够去除,其去除率可达99.0%以上,被处理后的废水中镍离子含量降低至0.09mg/L,达到排放标准。     

在大肠杆菌中表达蝮蛇毒类凝血酶基因gloshedobin

将大连蛇岛蝮蛇毒腺中的类凝血酶基因gloshedobin克隆到pET-32a(+)上,构建了T7启动子控制的大肠杆菌表达质粒,并考察了质粒的稳定性. 采用IPTG诱导,以融合蛋白的形式进行表达,得到以包涵体形式存在的类凝血酶. 通过实验对诱导时间、诱导温度及诱导剂浓度进行了优化,并采用正交实验考察了金属离子对表达的影响,结果表明Fe3＋, Co2＋对类凝血酶的表达有促进作用.     

葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及一步纯化

从绿色木霉中克隆了葡萄糖苷酶bg基因,构建入表达载体pPIC9k-His6中,然后在AOX1启动子的控制下,在毕赤酵母GS115菌株中表达. 在5 L发酵罐中发酵120 h,重组P. pastoris Mut+菌株湿重达360.6 g/L,葡萄糖苷酶浓度和酶活分别为2.1 mg/mL和73.5 U/mL. 经亲和层析一步纯化后,得到了电泳纯的葡萄糖苷酶. HPLC分析显示其纯度为95.6%,比酶活为71.9 U/mg. 纯化过程酶得率为73.6%,纯化倍数为42.6. 纯酶的等电点为5.0,最适温度为50℃,最适pH为6.5. 金属离子Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe2+及SDS对葡萄糖苷酶活性有抑制作用,而Mg2+, Mn2+, K+能增强葡萄糖苷酶活性,其中1 mol/L Mg2+能使酶活提高20%.     

用于臭氧催化氧化处理抗生素废水的催化剂的制备

以氧化镍、氧化铜为活性组分,以γ-Al_2O_3为载体,采用浸渍的方法制备催化剂,考察了各因素对催化剂活性的影响。结果表明,负载氧化镍和氧化铜的催化剂活性较高,在浸渍液浓度为1 mol/L,镍铜离子浓度配比为2∶1,干燥时间为2 h,焙烧时间为3 h,焙烧温度为500℃条件下制备的催化剂用于抗生素废水的处理,在臭氧流量为2 L/min,pH=7,催化剂投加质量浓度为1 g/L,反应时间为50 min条件下,废水COD的去除率为52.10%。     

短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基的优化

胸苷磷酸化酶在核苷类物质合成中具有重要作用,本研究以短乳杆菌为胸苷磷酸化酶生产菌种,对短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基进行优化。首先通过Plackett-Burman设计筛选出影响短乳杆菌产胸苷磷酸化酶的3个较为重要因素：发酵时间（P=0.030）、接种量（P=0.033）和葡萄糖浓度（P=0.019）。在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并利用响应面中心组合设计对影响显著因素进行优化,得到最适培养基组成成分和培养条件为：发酵初始pH 8.0,葡萄糖18 g/L,酵母膏15 g/L,NaCl 7.5 g/L,蛋白胨10 g/L,胸苷15 mmol/L,摇床转速110 r/min,发酵温度38 ℃,发酵时间10.57 h,接种量1.54%。在此优化条件下,短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力得到了很大提高,短乳杆菌胸苷磷酸化酶活从0.400 U/mg湿菌体提高到1.172 U/mg湿菌体,比优化前提高了2.93倍。蛋白质凝胶电泳分析显示经优化后每克湿菌体胸苷磷酸化酶的含量明显高于优化前。