培养温度对基因工程菌生长密度和rhG-CSF表达的影响

观察培养温度对重组人粒细胞集落刺激因子的基因工程菌 p CG- 1/ rh G- CSF/ DH5α生长密度和 rh G-CSF表达的影响发现 ,在培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量 ,并可缩短培养周期。通过在 NBS MPP- 40大罐中进行 3批发酵 ,每批发酵 15 h,平均菌密度 A6 0 0 为 2 5 .0 ,菌干重 2 3g/L ,rh G- CSF表达量可达 2 6 .93%。     

α2a型基因工程干扰素发酵工艺的改进

应用自行设计的适宜PBV320／7118－α2a工程菌发酵的程序控制和“流加式”培养方法，各连续培养了3批工程菌，产量提高1倍以上，干扰素表达量提高1～3倍。该工艺稳定、简便、省时、省力。     

调节发酵温度提高干扰素的表达

<正> 我们应用中国预防医学科学院病毒学研究所组建的α-干扰素工程菌,观察了发酵温度与干扰素的表达。发酵罐为日本丸菱株式会社的MSJ-U_(13)型30升培养装置。温度、pH、空气流量、溶解氧、转数等主要参数自控调节。培养基为全综合发酵培养基。工程菌在30℃培养,3小时后开始采样测OD_(600A)并将样品转温至42℃摇床培养,观察生长动态与干扰素表达的关系。结果发现,工程菌生长至稳定期转     

表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2：M4=1：1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9～7.4,DO为40%～60%,细胞密度达到7.0×10⁶cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。     

pRL-hTNF/JM103工程菌发酵和rhTNFα表达的研究

为便于下游中试规模生产,采用温度敏感型启动子PRPL构建rhTNFα工程菌,并对影响工程菌发酵培养和表达的因素进行了初步研究。结果显示,采用RTB培养基,50℃热水快速升温,诱导培养4～4．5h,湿菌体收获率和表达量均达到较高水平;50L发酵罐连续发酵3批,14000r／min连续离心,菌体收获率湿重达16．gg／L培养物,rhTNFα表达量占菌体总蛋白的10.5％,活性达1．35×107U／mg蛋白。.     

α2b—基因工程干扰素发酵培养基的优化

以LB和M9培养基为基本成分，运用均匀设计方法对α2b—基因工程干扰素发酵培养基的组成和配比进行了优化。所得适宜工程菌PBV321／BMH—71—18生长和rIFN—α2b表达的发酵培养基，经摇床培养，rIFN－α2b表达水平为5．0×105IU／ml培养液，分别是LB和LB＋M9培养基表达量的6倍和3倍。     

培养基因工程菌表达未酰化胸腺素α1的研究

通过摇瓶培养对含有Thymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21的生长和融合蛋白表达进行了研究.选择LB和TH培养基,考察了培养温度、摇瓶中培养基盛装量、葡萄糖添加量、诱导剂IPTG浓度、诱导时间等因素对工程菌生长和融合蛋白表达的影响.确定最适生长温度为35～37℃、最佳蛋白表达温度为30℃,对数生长中期诱导,诱导剂浓度为0.4～0.5 mmol·L-1,诱导时间为4～6 h.其融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的26.83%.     

表达重组谷氨酸脱羧酶工程菌发酵条件的优化

目的对表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,EC4.1.1.15,简称GAD或GDC)的重组大肠杆菌的发酵条件进行优化。方法通过单因素试验优化表达GAD的重组大肠杆菌B3C1的诱导剂IPTG添加时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度,再经响应面分析法优化工程菌的发酵条件(氯化钠、胰化蛋白胨、酵母粉、摇床转速、初始pH值、培养时间、接种量、装液量)。结果工程菌的最佳诱导条件为:IPTG添加时间为工程菌接种后4 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为35℃;工程菌的最佳发酵条件为:酵母粉1.01%,氯化钠0.6%,胰化蛋白胨1.5%,培养时间11.25 h,摇床转速250 r/min,初始pH值6.5,接种量3.0%,装液量11.70 ml。工程菌在该条件下发酵培养,GAD酶活达1 227.33 U,比优化前提高了12.29%。结论已成功对表达GAD的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,为其工业化生产奠定了基础。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。     

含抗菌肽CC31毕赤酵母工程菌培养基及其培养条件的优化

目的筛选毕赤酵母工程菌培养基的主要组分,优化工程菌培养条件。方法采用毕赤酵母工程菌CC31发酵培养抗菌肽CC31,选取基础盐培养基(basic salt medium,BSM)为初始培养基,利用单因素试验、正交试验设计对培养基的碳源、氮源、酵母营养物进行筛选;选取最适培养基对菌种接种量、培养基初始pH值、培养温度进行培养条件优化。结果经鉴定,抗菌肽CC31相对分子质量为13 620;初始BSM培养基添加组分中碳源为3%甘油和3%葡萄糖,酵母营养物为1%酵母浸出物,氮源为1. 5%硫酸铵;在10%接种量、培养基初始pH值为6,培养温度为30℃的培养条件下,获得的抗菌肽CC31蛋白浓度可达82 mg/L。结论优化了毕赤酵母工程菌培养基组分及培养条件,获得高表达量的重组蛋白,为工业化高密度发酵提供了实验依据。     

密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵

目的　研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件。方法　将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子 ,人工合成hEPO全基因 ,然后将其插入表达载体PBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,挑选构建正确的PBV2 2 0 hEPO DH5α菌落 ,经升温诱导 ,SDS- PAGE和Westernblot鉴定表达产物 ;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响。结果　经酶切分析 ,DNA测序鉴定 ,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中。通过高密度发酵培养 ,最终菌体密度达A6 0 0 =30 (相当于菌体 35g L) ,hEPO表达量达 30 %左右。结论　人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达 ,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。     

氮源对酵母工程菌株生产α-淀粉酶的影响

在摇瓶培养条件下 ,研究了氮源对含重组质粒 p NA3的酿酒酵母 2 0 B- 12生产α-淀粉酶的影响。结果表明 :在葡萄糖去阻遏条件下必须有天然氮源存在 ,基因表达才能被诱导 ;几种天然氮源中酵母膏诱导效果最好 ,当酵母膏的添加量为 2 0 g/ L时 ,发酵液中α-淀粉酶的最大活力达 1.97U/ m L ,最大菌体密度为 0 .97g/L。各种天然氮源的添加量必须适中 ,否则会抑制工程菌的生长和基因表     

诱导条件对重组大肠杆菌发酵中人白细胞介素6表达量的影响

对重组人白细胞介素6 (rhIL-6)大肠杆菌摇瓶发酵工艺作了研究.探讨了诱导策略对菌体生长和rhIL-6表达量的影响.结果表明,含有温敏扩增型质粒pKpL3a的重组hIL-6大肠杆菌,在2×YT培养基中发酵,接种量为0.2%,于30℃,180 r/min摇瓶中培养,当菌密度OD 600约为1.5时,转至42℃或40℃诱导,维持时间至少为1 h,然后转至37℃培养3 h,最终rhIL-6表达量可达32%.于40℃或42℃下诱导时间低于1 h,则使最终rhIL-6表达量降低 .如果采用42℃或40℃恒温诱导,rhIL-6表达量仅为20%.     

表达人肝细胞生长因子突变体——NK4工程菌的发酵工艺研究

目的　建立重组NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法　采用锥形瓶、发酵罐发酵 ,对工程菌生长和表达条件如pH、诱导时间及诱导剂浓度等方面进行优化。确定其最佳诱导表达条件 ,在 15L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果　在 15L发酵罐进行工程菌发酵 ,菌体收获量湿重可达 2 4 .6g L± 0 .98g L ,目的蛋白的表达量保持在菌体总蛋白的 5 0 %左右 ,发酵时间为 11h。结论　建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。     

分泌型重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中试发酵工艺的研究

通过对GM－CSF工程菌W3100发酵条件的研究，优化了培养及表达条件，使工程菌W3100在30L发酵罐可表达分泌型GM－CSF1.5g／L左右，占菌体总蛋白的25％以上，纯化后的比活大于2．0×107。