基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/L h、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/(L·h)、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

发酵乳杆菌C6全细胞催化剂的制备及产D-塔格糖催化条件优化

以L-阿拉伯糖异构酶产生菌发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)C6为全细胞催化剂,对其发酵制备工艺以及生物转化D-塔格糖的催化反应条件和细胞透性化学处理方式进行优化。结果表明,菌株C6以最优培养基配方(葡萄糖10 g/L,酵母浸粉20 g/L,蛋白胨20 g/L,无水乙酸钠10 g/L,MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L,MnSO₄·2H₂O 0.05 g/L,K₂HPO₄0.4 g/L,L-阿拉伯糖3 g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.04 g/L,生物素100μg/L,焦磷酸硫胺素400μg/L)在最优发酵条件(发酵温度37℃、初始pH值7.5、装液量70 mL/150 mL、接种量1%)下培养24 h,生物量(OD_{600 nm}值=1.25)和L-阿拉伯糖异构酶酶活(107.81 U/mL)较优化前分别提高了92.31%和116.44%;全细胞催化剂在优化的催化...     

产葡萄糖氧化酶菌株的筛选及发酵培养基的优化

从土壤中筛选出了一株产葡萄糖氧化酶较高的菌株,利用响应面法对该菌株的产酶培养基进行优化以提高产酶量。响应面法优化的发酵培养基组成为：葡萄糖109.41g/L、复合氮源(m(月示蛋白胨):m((NH₄)₂SO₄)=3:1)37.36g/L、吐温-80 37.15g/L、KH₂PO₄ 2g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.7g/L 和KCl 0.5g/L。采用该优化培养基所得葡萄糖氧化酶的活力为1.54U/mL,较优化前提高了31.6%。     

红酵母Y-5产类胡萝卜素培养基无机盐组分的优化

为提高红酵母菌株Y-5 发酵产类胡萝卜素的产量,对培养基中无机盐组分进行优化。采用Plackett-Burman试验设计从8 种无机盐中筛选出对提高类胡萝卜素产量具有显著效应的无机盐组分KH₂PO₄、MgSO₄ 和NaCl。通过Box-Behnken 设计及响应面分析确定其质量浓度为KH₂PO₄ 0.58g/L、MgSO₄ 0.49g/L、NaCl 0.28g/L 时,菌株的类胡萝卜素产量达到14.51mg/L,与未添加无机盐组分培养基相比,类胡萝卜素产量提高了25.09%。     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为表达平台,海藻糖合酶为表达蛋白,研究了单启动子和多个启动子串联对外源蛋白表达的影响。分别选择6个启动子构建P_(srfA)、P_(43)单启动子和P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)四个时期特异性启动子串联表达系统进行验证。根据实验结果分析,组成型启动子P_(43)转录强度最高,摇瓶中酶活达到3 381 U/g,串联启动子P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)强度次之。针对验证酶活最高的重组菌pHT01-P_(43)-treS进行发酵优化,并在5 L发酵罐中进行放大实验,酶活达到7 215 U/g。实现了海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中自诱导高效表达,为获得高效率制备海藻糖合成酶的表达系统奠定了基础。     

基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L. lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L. lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L. lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P₃₂和P₈为启动子、以及Tusp₄₅和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L. lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养...     

增强乙醛酸循环对大肠杆菌合成L-苏氨酸的影响

L-苏氨酸是人类必需氨基酸,在医药、食品、饲料领域有广泛的应用。在L-苏氨酸发酵生产过程中,乙醛酸循环起到部分回补途径的功能。本实验利用Red重组技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,构建了icl R基因缺失菌株THRDΔicl R以及不同强度启动子替换ace BAK启动子的菌株THRD P1和THRD P2。通过实时荧光定量PCR检测表明,苹果酸合酶基因(ace B)的表达量分别是原菌的1.89倍、2.11倍以及2.96倍。摇瓶发酵结果显示,THRDΔicl R的L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为42.60±1.23 g/L和32.77 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别提高20.61%和20.70%。THRD P1 L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为36.50±1.42 g/L和28.08 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别提高3.34%和3.39%。而THRD P2 8 h后菌体生长停滞,L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为8.31±1.31 g/L和20.78 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别降低了76.47%和23.52%。综上所述,适当增强乙醛酸循环有利于L-苏氨酸的积累,而过强的乙醛酸循环影响菌体的正常代谢。     

中慢生型天山根瘤菌MsiR组成型蛋白突变株的筛选

MsiR蛋白来源于中慢生型天山根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense）,是LysR转录调控蛋白家族中的一员,它可以响应宿主植物释放的抗代谢物-刀豆氨酸,激活外运蛋白msiA编码基因的转录表达。通过构建MsiR突变文库,筛选得到了7个MsiR组成型突变蛋白,L166P、A147V、P83L、A278T组成型突变蛋白丧失了对刀豆氨酸的响应,在没有刀豆氨酸时的荧光值为800左右;A147T、E59G组成型突变蛋白仍然可以响应刀豆氨酸的诱导信号,添加刀豆氨酸时荧光值是未添加时的1.7倍。通过蛋白同源建模分析了组成型突变的氨基酸残基在MsiR蛋白上的空间分布及其对MsiR蛋白调控功能可能的影响。组成型突变蛋白的研究对进一步揭示LysR家族蛋白转录调控的机理有重要意义。     

基于钝齿棒杆菌argGH启动子改造的L-瓜氨酸高效合成

L-瓜氨酸是尿素循环的重要中间体,在argGH编码酶的催化下易分解为L-精氨酸,在微生物体内难以大量积累。作者通过启动子替换手段,以弱启动子P-dapAB6替换调控argGH表达的启动子P-argG,构建了弱化L-瓜氨酸分解代谢途径的重组菌株Corynebacterium crenatum H-7-PdapAB6:argGH。重组菌株的转录水平和酶活力结果显示,重组菌株分解途径中argG和argH的基因表达水平下调,精胺琥珀酸合成酶ASS(argG编码)和精胺琥珀酸裂解酶ASL(argH编码)酶活分别降低91.80%和55.35%。摇瓶发酵结果表明,L-瓜氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度分别为33.85 g/L、0.25 g/g和0.34 g/(L·h),较原始菌株分别提高了4.91、5.00和4.86倍。通过启动子替换策略,构建了L-瓜氨酸分解代谢途径弱化的工程菌株,初步实现了L-瓜氨酸的高效合成。     

黄色短杆菌B-003产L-精氨酸发酵条件的研究

目的通过对摇瓶发酵条件的研究，提高黄色短杆菌B-003 L-精氨酸的产量。方法在单因素实验的基础上，利用响应面法，以L-精氨酸的产量为响应值，研究L-精氨酸摇瓶发酵条件。结果 Plackett-Burman设计筛选出3个对L-精氨酸产量有显著影响的因素：葡萄糖、硫酸铵和磷酸二氢钾的浓度，通过Box-Behnken试验设计得出，葡萄糖的浓度为99.57 g/L，硫酸铵浓度为60.80 g/L，磷酸二氢钾浓度为2.18 g/L时L-精氨酸产量最高。结论在最佳培养条件下，L-精氨酸产量达24.10 g/L，与最初培养条件相比产量提高了58.55%。     

响应面法优化弗托氏葡糖酸杆菌产羟基乙酸工艺条件

采用响应面法对弗托氏葡糖酸杆菌产羟基乙酸的工艺条件进行了优化。首先利用单因素实验、Plackett-Burman试验设计筛选出影响羟基乙酸产量的3个主要因素:山梨醇浓度、酵母粉浓度、乙二醇浓度。在这个基础上用最陡爬坡法来逼近最大响应值范围,然后利用响应面分析法确定这几个主要因素之间的交互作用和最佳条件。结果表明,山梨醇浓度40.30 g/L、酵母粉浓度36.90 g/L、CaCO₃浓度2.50 g/L、乙二醇浓度28.14 g/L、发酵温度30 ℃、pH7、接种量10％（v/v）、转速200 r/min、发酵时间48 h,在此优化条件下,经过三次重复平行试验求平均值,Gluconobacter frateurii HD924羟基乙酸产量达到21.04 g/L,与响应面预测产量相近,与优化前相比,羟基乙酸转化率提高了28.25％,转化率达到了74.77％,生产强度为10.52 g/(L·d)。     

鹰嘴豆慢生根瘤菌USDA 3378发酵条件优化

该研究通过比较中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)USDA 3378在酵母甘露醇琼脂(YMA)、酵母胰蛋白胨(TY)及修正YMA(MYMA)培养基中的生长情况，初步筛选最佳培养基。采用单因素试验及Box-Behnken响应面试验优化菌株USDA 3378发酵条件，并通过发酵罐扩大培养评价菌株USDA 3378的生长情况。结果表明，Mesorhizobium ciceri USDA 3378初筛培养基为YMA，其最佳发酵条件为甘露醇12 g/L，酵母粉8.75 g/L,KH₂PO₄0.25 g/L,K₂HPO₄0.25 g/L，无水Mg SO₄0.1 g/L,Na Cl 0.l g/L，接种量4%(V/V)。在此优化条件下，OD_{600 nm}值为2.208，比优化前提高了35.54%。菌株USDA 3378在3 L发酵罐扩大培养后，OD_{600 nm}值为2.341，比优化前提高了10.42%。     

生物素及膜偶联间歇透析发酵对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

生物素作为微生物的生长因子,对生长速率、细胞膜通透性、代谢产物的生成等方面具有重要作用。为提高黄色短杆菌产L-亮氨酸产量,降低副产物生成,在30 L发酵罐水平研究了在培养基中添加20、50、80、120μg/L四种不同质量浓度生物素,对黄色短杆菌产L-亮氨酸的影响。结果表明:培养基中添加50μg/L生物素,黄色短杆菌发酵44 h,L-亮氨酸的产量最高,达到60 g/L,糖酸转化率为22%,副产物L-丙氨酸的质量浓度为8 g/L。在最适生物素浓度下,发酵36 h后,采用膜偶联间歇透析发酵工艺,发酵周期延长至56 h,L-亮氨酸的糖酸转化率为25%,较普通发酵工艺约提高13. 6%,副产物L-丙氨酸的浓度降低约71. 3%,L-亮氨酸的总产量提高了16. 7%。研究结果对提高糖利用率、降低副产物、提高生产效率等方面具有重要意义。     

褪黑素诱导sts基因表达提高葡萄白藜芦醇含量

目的：探讨外源褪黑素处理是否能够诱导葡萄茋类合酶（stilbene?synthase,STS）基因sts表达,进而提高葡萄白藜芦醇含量;为应用褪黑素来提高葡萄营养价值和揭示褪黑素调控白藜芦醇代谢的分子机理提供理论支持。方法：100?μmol/L褪黑素加表面活性剂浸泡转色早期的葡萄果穗,30?μmol/L褪黑素处理生长30?d左右的无菌组培苗根系;利用葡萄基因组数据库,结合RNA-Seq技术,鉴定葡萄上褪黑素诱导的sts基因家族成员,并用Clustalx和MEGA5软件进行序列分析和构建进化树,使用在线软件plantCARE分析sts基因启动子区域的顺式作用元件;实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测sts基因在褪黑素处理不同时间点的表达水平;高效液相色谱测定白藜芦醇含量。结果：RNA-Seq分析表明葡萄果实中有30?个sts基因被褪黑素处理诱导上调,占葡萄总sts基因的62.5%,占总上调基因的8.5%;褪黑素诱导的sts基因主要定位在16号染色体上,氨基酸序列高度保守,相似度达88.3%,同源性最高的STS蛋白间仅有1?个氨基酸差异;启动子序列分析表明sts基因具有相对保守的启动子序列,相似度在55.6%以上;根据蛋白质和启动子序列相似度,30?个sts基因均可划分为A、B、C三组,并且二者聚类结果基本一致,在A和B组sts启动子区域分别发现了一段高度保守的序列;作用元件分析表明,在sts启动子区存在脱落酸、乙烯、水杨酸和生长素等激素响应元件和MYB结合位点;褪黑素诱导的30?个sts基因在不同组织中具有不同的表达水平,总体上在根系中表达水平较高,果实中不同sts基因具有不同的转录丰度;通过qRT-PCR检测了5?个sts基因在褪黑素处理不同时间的表达水平与RNA-Seq结果一致,均受褪黑素诱导,但具有不同的表达响应模式。结论：褪黑素诱导上调了30?个葡萄sts基因,它们之间具有保守的蛋白序列和启动子序列,30?个sts基因启动子区域含有不同的作用元件,对褪黑素具有不同的表达响应模式;褪黑素处理能提高葡萄果实和根系中白藜芦醇含量。     

静息细胞转化赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖条件优化

应用响应面法设计对Gluconobacter kondonii静息细胞转化合成L-赤藓酮糖进行优化。在单因素试验基础上,利用响应面分析法(RSM)对转化条件进行优化,并建立了各因素与L-赤藓酮糖之间的数学模型。结果表明,静息细胞浓度、p H值、赤藓糖醇浓度、反应时间以及温度对L-赤藓酮糖产量均有不同程度影响。响应面预测产L-赤藓酮糖的最佳工艺为静息细胞浓度1.65%、赤藓糖醇浓度97.9 g/L、温度30.2℃、p H值为5,反应时间18 h,此时L-赤藓酮糖产量为96.1 g/L,与响应面极值相吻合,转化率为98.2%,生产强度达到5.34 g/(L·h),表明优化方案达到了预期效果。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化

研究生物合成硫模块对L-甲硫氨酸产量的影响并优化了发酵条件。利用实验室构建的重组菌株,用trc启动子替换基因组上cys K的组成型启动子,在质粒p A*H上插入glp E和nrd H基因;通过构建PG3启动子文库,获得转录强度最高的p32启动子,进一步优化硫模块,最后通过对培养基的优化提高了硫代硫酸盐的供给,从而提高L-甲硫氨酸产量。结果表明:使用构建得到的E. coli W3110 JAHFEBL trc-cys K/p A*H-p32-nrd H-glp E菌株,发酵48 h后L-甲硫氨酸摇瓶水平产量达到1. 3 g/L,较对照组提升了41. 5%;通过对培养基的进一步优化,L-甲硫氨酸产量最终达到2. 3 g/L,相比未优化的发酵水平提高了77. 0%,且该研究为其他含硫氨基酸的生物合成提供了基础。