鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白的制备及诱导小鼠抗体应答水平检测

目的制备鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平。方法以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取OmpK/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切及DNA测序鉴定。重组质粒转化大肠埃希菌BL21株,经IPTG诱导表达,镍亲和纯化柱纯化重组蛋白。小鼠背部皮下注射重组融合蛋白(20μg/只,体积50μL)和等体积完全弗氏佐剂,并于初次免疫后第14和21天相同剂量加强免疫1次,分别于末次免疫后7、21 d小鼠内眦取血,测定小鼠血清中抗原特异性抗体滴度。结果 PCR扩增获得约1 400 bp的基因片段,定向克隆筛选到约5 800 bp的重组质粒,纯化的重组融合蛋白相对分子质量约52 000,小鼠血清中检测到特异性IgG抗体,最高抗体滴度可达1∶102 400。结论成功制备了鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,小鼠血清中检测到高滴度特异性IgG抗体,为进一步研究其免疫活性奠定了基础。     

灭活人55型腺病毒在小鼠体内免疫原性的评价

目的评价灭活人55型腺病毒(human adenovirus-55,HAdV-55)在小鼠体内免疫原性。方法将HAdV-55(SF04/SC/2016)毒株经0. 1%甲醛60℃热灭活12 h。将灭活HAdV-55与弗氏完全佐剂等体积混合,充分乳化,皮下注射BALB/c小鼠,200μL/只;2周后,将灭活HAdV-55与弗氏不完全佐剂等体积混合,充分乳化,加强免疫2次,间隔2周,同时设PBS对照组。每次免疫1周后经小鼠静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清抗HAdV-55特异性抗体水平;通过免疫荧光法、ELISA法和体外中和试验检测末次免疫的血清抗体水平。结果灭活HAdV-55免疫小鼠产生了特异性抗HAdV-55抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度增大。灭活HAdV-55免疫小鼠血清可与HEp-2细胞内HAdV-55蛋白反应,产生荧光;总IgG水平均高于PBS对照组小鼠;可在HEp-2细胞上中和HAdV-55的感染,中和效价为1∶640~1∶1 280。结论灭活HAdV-55可作为免疫原诱导小鼠产生中和抗体,具有良好的免疫原性。     

登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性

目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ,转化至E.coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价。用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力。结果重组原核表达质粒p ET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37%;纯化的纯度可达90%以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1%的小鼠免受致死剂量DENV的攻击。结论成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力。本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础。     

重组金黄葡萄球菌肠毒素B及热休克蛋白65融合蛋白的原核表达及其在小鼠体内的体液免疫效果

目的原核表达重组金黄葡萄球菌肠毒素B(recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B,r SEB)及热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)融合蛋白r SEB-HSP65,并探讨其在小鼠体内的体液免疫效果。方法采用分子生物学方法将修改过TCR Vβ结合区的r SEB基因与HSP65基因融合,构建重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经铜柱亲和层析纯化。将纯化蛋白经小鼠背部皮下注射,分别于第0、14、28天各免疫1次,分别于第14、28、42 d经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-SEB的Ig G水平。结果重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白r SEB-HSP65的相对分子质量约85 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占全菌总蛋白的40.81%,纯化蛋白纯度约为90%。各组免疫小鼠均可产生较高滴度抗体,且在第14、28及42天大部分含铝佐剂疫苗组的效价显著高于相同剂量的无铝佐剂疫苗组(P<0.05),第42天时无铝佐剂低剂量疫苗组与含铝佐剂低剂疫苗量组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白r SEB-HSP65,且可诱导小鼠产生较高的抗体水平。     

单纯疱疹病毒2型表面糖蛋白D亚单位疫苗免疫佐剂的筛选及免疫方案优化

目的筛选单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)表面糖蛋白(glycoprotein)D2(g D2)亚单位疫苗的免疫佐剂,对免疫剂量、免疫次数等免疫方案进行优化。方法使用Alum佐剂、Poly I:C佐剂及Alum+Poly I:C混合佐剂,分别配伍不同剂量(2、5、10μg)的gD2蛋白,共制成9种注射制剂,经后腿肌肉注射免疫9组雌性BALB/c小鼠,分别于初次免疫后第28和42天各加强免疫1次,于初次免疫后28 d及第2、3次免疫后14 d,经眼眶静脉窦取血,分离血清,ELISA法检测特异性抗g D2抗体效价;脱颈椎处死小鼠,分离研磨脾脏后,获得脾细胞,加入gD2抗原刺激培养71 h后,收集细胞上清,应用CBA试剂盒测定细胞因子(IL-2、IFNγ、TNF-α)浓度;确定最佳免疫方案。结果初次免疫后28 d,各组总抗体效价偏低,混合佐剂(Alum+Poly I:C)配伍10μg抗原组小鼠血清抗体效价最高,但动物个体差异大。第2次免疫后14 d,各组小鼠血清抗体效价较第1次免疫显著增高;佐剂及抗原剂量对抗体效价影响显著,其中Poly I:C佐剂配伍10μg抗原组小鼠抗体效价及细胞因子分泌水平综合最高。末次免疫后14 d,小鼠血清中抗体效价较第2次免疫再次升高,动物个体间效价差异缩小,混合佐剂组效价最高;各组细胞因子分泌水平较第2次免疫略有增高,混合佐剂配伍2μg抗原组分泌高水平的IL-2、IFNγ、TNF-α。结论小鼠免疫模型中,使用Alum+Poly I:C混合佐剂较使用任一单独佐剂可产生最佳免疫效果,最佳免疫组为混合佐剂配伍2μg抗原组,最佳免疫次数为3次,第1和2次免疫间隔28 d,第2和第3次免疫间隔14 d,最佳免疫剂量为2μg/只小鼠。     

α-甘露糖肽作为佐剂对恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响

目的探讨α-甘露糖肽(α-mannatide)作为佐剂对恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响。方法将小鼠随机分为4组:疫苗组(M.RCAg-1)、疫苗佐剂组(M.RCAg-1+α-mannatide)、佐剂对照组(α-mannatide)、弗氏佐剂对照组(M.RCAg-1+Freund’s),分别于第0、14、28天经背部皮下免疫小鼠,0.1 ml/只。采用ELISA法检测3次免疫后小鼠血清Ig G抗体水平、抗体亚型以及血清抗体对单表位的识别,间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,ELISPOT检测其细胞因子的分泌水平。结果 3次免疫后,疫苗佐剂组GMT明显高于疫苗组(P0.05);疫苗佐剂组GMT与弗氏佐剂对照组持平(P0.05)。疫苗佐剂组产生的高水平Ig G主要以Ig G1为主。疫苗佐剂组抗体对单表位和天然虫体的识别效果显著。免疫小鼠各表位和蛋白诱发分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IFNγ的特异性淋巴细胞克隆数(P0.05)。结论α-mannatide作为恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1的佐剂能诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,具有一定的抗疟原虫感染保护作用。     

肺炎链球菌神经氨酸酶nanA蛋白的原核表达、纯化及其免疫保护效果

目的原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)神经氨酸酶nan A蛋白,并在小鼠模型中检测其保护效果,评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性。方法构建重组原核表达质粒p ET28a(+)-nan A,重组nan A蛋白经IPTG诱导及Ni-NTA亲和层析柱纯化后,采用黏膜(与CT佐剂混合)和腹腔(与Alum佐剂混合)给药途径免疫BALB/c小鼠,建立相应的S.pn感染模型,同时设相应对照组(佐剂+PBS),ELISA法检测特异性抗体及亚型;小鼠鼻腔滴定试验检测主动免疫保护效果;体内抗定植试验检测nan A蛋白对19F型S.pn在鼻咽部定植的保护作用。结果重组表达质粒p ET28a(+)-nan A经双酶切(NdeⅠ/XhoⅠ)及测序鉴定证明构建正确;重组蛋白的相对分子质量为55 000,主要以可溶性形式表达,约占菌体总蛋白的55%,纯化后纯度达90%;黏膜免疫组小鼠唾液中Ig A及Ig G效价分别为1.6×103和3.2×102,血清中Ig G效价为2.0×106,亚型主要为Ig G2a;腹腔免疫组血清中Ig G效价为0.5×106,亚型主要为Ig G1;黏膜和腹腔免疫小鼠生存时间较相应对照组显著延长(P0.05),黏膜免疫组小鼠生存率较其对照组显著增加;黏膜免疫可显著降低S.pn 19F在宿主鼻咽部和肺部的定植。结论原核表达并纯化了nan A蛋白,诱导的小鼠免疫反应可有效抵抗S.pn的感染,并可显著降低S.pn在宿主鼻咽部及肺部的定植,表明nan A蛋白是较理想的S.pn疫苗候选蛋白。     

两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响

目的比较两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为02、03佐剂组、Pr组和NS组,每组24只。02、03佐剂组、Pr组分别经大腿内侧肌肉注射15μg恶性疟原虫融合蛋白-2.9(combine protein 2.9 of Plasmodium falciparum,PfCP-2.9)+15μg恶性疟原虫环孢子蛋白-2(circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum 2,PfCSP-2)+02佐剂系统[75μg BCG-CpG-DNA+0.2 mg A(lOH)3)]、15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2+03佐剂系统[(50μg PolyI:C+0.2 mg A(lOH)3]和15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2,NS组注射生理盐水。隔周免疫1次,共5次,于初次免疫2周后每周内眦采血,分离血清,采用ELISA法检测血清IgG值及抗体效价;于2、3、4、5次免疫后2周,无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用ELISPOT法,对分泌IFNγ、IL-2、IL-4的特异性淋巴细胞数量进行检测。结果 02佐剂组小鼠血清IgG抗体效价在2次免疫后2周即可达到1∶105,03佐剂组在3次免疫后1周达到1∶105,而Pr组在5次免疫后2周达到1∶105,4次免疫后02、03佐剂组达到最高值。分泌IL-4的特异性淋巴细胞数,03佐剂组均明显高于02佐剂组、Pr组及NS组,02佐剂组3、4、5次免疫后才明显高于NS组,5次免疫后才明显高于Pr组(P均0.05);分泌IL-2的特异性淋巴细胞数,02佐剂组与03佐剂组比较差异无统计学意义(P0.05),3次免疫后02、03佐剂组均明显高于NS组,且03佐剂组也明显高于Pr组,4次免疫后02、03佐剂组、Pr组均明显高于NS组(P均0.05),但三者之间差异无统计学意义(P0.05);分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数,02、03佐剂组、Pr组间差异无统计学意义(P0.05),且03佐剂组在3次免疫后明显高于NS组,而02佐剂组、Pr组在5次免疫后才明显高于NS组(P均0.05);02、03佐剂组分别在3、5次免疫后分泌IL-4的特异性淋巴细胞数量达到最高,且分别在5、3次免疫后,分泌IL-2的特异性淋巴细胞数量达到最高,二者均需5次免疫后分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数量才可达到最高。结论 03佐剂系统可更加有效地增强重组疟疾蛋白疫苗的免疫原性,诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫反应,5次免疫后可达到最佳免疫效果。     

不同佐剂和免疫途径对结核分枝杆菌多表位融合蛋白TP15免疫原性的影响

目的探讨不同佐剂和免疫途径对结核分枝杆菌多表位融合蛋白TP15免疫原性的影响。方法制备多表位融合蛋白TP15,分别以MF59和h BCG单独或联合作为佐剂,经皮下或肌肉注射BALB/c小鼠,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗TP15特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体,流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中多功能CD4~+T细胞含量,夹心ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中细胞因子IL-1β和IL-12的含量。结果多表位融合蛋白TP15免疫小鼠只产生抗TP15特异性Ig G和Ig G1抗体,不产生Ig G2a抗体。MF59和h BCG单独或联合作为TP15抗原佐剂,皮下注射和肌肉注射均能显著提高机体抗TP15特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体水平,且复合佐剂MF59+h BCG的免疫效果更佳。MF59和h BCG单独或联合作为TP15抗原佐剂,皮下注射较肌肉注射更有利于产生Ig G2a抗体,其中复合佐剂MF59+h BCG疫苗免疫小鼠产生Ig G2a抗体的效果最佳,且Ig G1/Ig G2a值显著低于肌肉注射。MF59和h BCG单独或联合作为TP15抗原佐剂经皮下免疫小鼠,脾淋巴细胞IL-2~+CD4~+T细胞含量增加,IL-10~+CD4~+T细胞含量减少,腹腔巨噬细胞分泌IL-1β和IL-12水平增强。结论 MF59+h BCG复合佐剂诱导Th1型细胞免疫漂移,且皮下注射免疫效果优于肌肉注射。     

高效价抗肠道病毒71型兔血清的制备及鉴定

目的制备高效价的抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)兔血清。方法分别用RD细胞和Vero细胞培养EV71,纯化后,将经甲醛灭活和未灭活的EV71抗原分别加入佐剂或不加佐剂,经不同途径(肌肉、皮下、腹腔)免疫家兔,每周采血,分离血清,分别采用ELISA、免疫双扩散、免疫荧光和中和抗体试验检测兔血清抗体效价,并分析不同方法检测兔血清抗体结果的相关性。结果未灭活和灭活的纯化EV71抗原加弗氏佐剂后,经皮下或肌肉途径免疫家兔均可获得高效价的抗EV71兔血清,其中加弗氏佐剂的灭活疫苗经皮下途径免疫获得了最高滴度的中和抗体;当抗血清ELISA效价达到或接近1∶108,免疫双扩散效价达到或接近1∶512,抗血清1∶2 000稀释后荧光强度荻时,可进行免疫家兔的全血采集;不同方法免疫家兔全血采集的血清中和抗体效价为29 406~1 280 652 U/0.2 ml;免疫双扩散检测与中和抗体和免疫荧光检测结果的相关性较高。结论获得了高效价的抗EV71兔血清,为EV71疫苗抗原的相关检定创造了条件。     

重组弓形虫热休克蛋白70联合弗氏佐剂免疫小鼠的抗弓形虫感染作用

目的评价重组弓形虫热休克蛋白70(rTgHSP70)联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠的抗弓形虫感染作用。方法BALB/c小鼠70只,随机分为7组,分别为PBS组、A组(佐剂+PBS)、20PA组(20μg rTgHSP70+佐剂)、40P组(40μgrTgH-SP70)、40PA组(40μg rTgHSP70+佐剂)、60PA组(60μg rTgHSP70+佐剂)及80PA组(80μg rTgHSP70+佐剂),皮下免疫,间隔2周,加强免疫2次,共免疫3次。末次免疫后14d,用2×104个RH株弓形虫速殖子/只灌胃攻击各组小鼠,攻击后30d处死,ELISA检测血清IgG和肠液sIgA;分离脑组织内弓形虫速殖子,并计数。结果在添加佐剂组中,血清IgG水平随rTgHSP70剂量的增加而升高,与PBS组和A组比较,差异有统计学意义;肠液sIgA水平60PA组最高,与20PA和40PA组比较,差异有统计学意义;与PBS组相比,A、20PA、40P、40PA、60PA和80PA组的脑组织内速殖子数分别减少了56.87%、56.46%、61.90%、48.74%、62.87%和70.44%。结论rTgHSP70联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠可诱导一定的抗弓形虫感染作用,80μgrTgHSP70为较佳剂量。     

辅助性CD4~+ T细胞亚群失衡在实验性自身免疫性重症肌无力大鼠发病机制中的作用

目的研究实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)大鼠发病过程中辅助性CD4+T细胞亚型的变化。方法将Lewis大鼠分为完全弗氏佐剂(CFA)早、晚期发病时对照相和EAMG早期(初次免疫后13d)、高峰期(初次免疫后50d)发病时相4组,各组分别给予相应的药物后,于发病早期和高峰期分离淋巴细胞,采用流式细胞术检测各组大鼠淋巴细胞中Th1、Th2、Th17和Treg细胞的比例,ELISA法检测淋巴细胞培养上清中各种细胞因子水平。结果在EAMG发病的早期时相,与CFA组比较,EAMG组Th1、Th2、Th17细胞的比例下降,而Treg细胞比例上升;淋巴细胞培养上清中IFNγ和IL-4水平显著下降(P<0.05),IL-6水平显著升高(P<0.05),IL-17和TGF-β水平略升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。在EAMG发病的高峰期,与CFA组比较,EAMG组Th1和Th17细胞的比例显著上升(P<0.05),而Th2和Treg细胞的比例显著下降(P<0.05),淋巴细胞培养上清中IFNγ和IL-17水平显著上升(P<0.05),IL-4和TGF-β水平显著下降(P<0.01),IL-6水平略上升,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论在EAMG发生过程中,4种辅助性CD4+T细胞亚型之间的平衡被打破,晚期时相中Th1和Th17细胞比例上升,而Th2和Treg细胞比例下降。     

重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合白细胞介素-2或干扰素γ诱导小鼠的脾淋巴细胞免疫应答

目的观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2(Recombinant Toxoplasma gondii phosphoglycerate mutase 2,rTgPGAM2)联合白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)或干扰素γ(Interferonγ,IFNγ)滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答,探讨IL-2和IFNγ的佐剂效应。方法将48只BALB/c小鼠随机均分为6组:rTgPGAM2组(30μg)、IL-2组(500 IU)、IFNγ组(1 000 IU)、rTgPGAM2(30μg)+IL-2(500 IU)组和rTgPGAM2(30μg)+IFNγ(1 000 IU)组和对照组(20μl PBS),免疫途径均为滴鼻免疫,共免疫3次。末次免疫后第14天,颈椎脱臼处死小鼠,CCK-8法检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖活性,ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4和IL-10水平。结果经rTgPGAM2刺激后,与对照组比较,各免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数(Stimulation index,SI)均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ组显著高于rTgPGAM2组(P<0.01或P<0.05);经ConA刺激后,仅IL-2组SI显著高于对照组(P<0.01)。各免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-2和IFNγ含量均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ组显著高于rTgPGAM2组(P<0.01或P<0.05);rTgPGAM2组及其联合IL-2或IFNγ组IL-4含量显著高于对照组(P<0.05);而IL-10的含量,只有IFNγ组和rTgPGAM2+IFNγ组显著高于对照组(P<0.05)。结论 rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ鼻内免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答优于rTgPGAM2单独免疫,表明IL-2和IFNγ具有良好的佐剂效应,IL-2的佐剂效应更佳。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。     

人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性

目的在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4(30μg/只)、TB10.4-F1(30μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1 d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。     

胸膜肺炎放线杆菌血清型特异的疫苗候选基因的筛选及痤疮丙酸杆菌异源免疫

目的筛选猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)1型与5型特异的疫苗候选基因,并研究痤疮丙酸杆菌对猪传染性胸膜肺炎的异源免疫。方法采用cDNA代表性差异分析、大肠杆菌核糖体展示、免疫筛选和RT-PCR技术筛选APP1型和5型血清型特异的疫苗候选基因,进行克隆、测序及同源序列分析。并用与APP疫苗候选基因具有同源序列的痤疮丙酸杆菌(PA)免疫小鼠,研究其对APP感染的异源免疫。结果获得血清1型APP6条疫苗候选基因,2条为未知基因,2条与PA同源性为98%,2条与人cDNA有同源性。获得血清5型APP7条疫苗候选基因,其中2条为未知基因,2条与PA同源性分别为93%和100%。用PA全菌免疫小鼠,产生的抗血清可与1型和5型APP发生强的免疫反应,ELISA检测效价达1∶3200;脾淋巴细胞检测结果显示,免疫组CD3+、CD4+T细胞的百分率及CD4+/CD8+比值与对照组相比均升高,两组CD3+T细胞百分率差异有显著意义。以10倍LD501型和5型APP分别感染PA免疫小鼠,小鼠存活率分别为95%和90%,并且在攻毒后第15天体内APP可全部被清除。结论1型与5型APP存在不同的疫苗候选基因,痤疮丙酸杆菌与之存在共同抗原,能够产生交叉免疫应答,对血清1型和5型APP的感染具有预防作用。     

1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8~+T细胞对病理性CD4~+T细胞的抑制作用

目的观察1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8+T细胞对病理性CD4+T细胞的抑制作用。方法用1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠,并同时设立噬菌体空载体免疫组和未免疫空白对照组。于初次免疫后第20周,检测各组小鼠血糖;磁珠法分离免疫小鼠CD8+T细胞,并用合成反义肽及IL-2诱导刺激作为效应细胞;分离噬菌体空载体免疫组和空白对照组小鼠CD4+T细胞,用合成正义肽及IL-2诱导刺激作为靶细胞。将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL的杀伤活性。结果初次免疫后第20周,1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组小鼠血糖水平保持正常,而另外2组小鼠血糖均高于正常水平。1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组诱导的CD8+T细胞作效应细胞,当效靶比为100∶1时,对噬菌体空载体免疫组CD4+T细胞的杀伤效率最高,达47.95%±11.30%,而噬菌体空载体免疫组诱导的小鼠CD8+T细胞对空白对照组的CD4+T细胞无杀伤作用。结论1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗能够诱导CD8+T细胞抑制病理性CD4+T细胞。     

狂犬病疫苗脂质体冻干粉的免疫原性评价

目的评价狂犬病疫苗脂质体冻干粉的免疫原性。方法将狂犬病疫苗原液稀释至15 IU/mL,制备为稀释液冻干粉(Y1组);将该稀释液冻干粉与脂质体冻干粉按5∶3的体积比混合,制成物理混合物(Y2组);同时采用冻融-冻干法将狂犬病疫苗稀释液和脂质体配制成狂犬病疫苗脂质体冻干粉(Y3组)。将各组疫苗复溶后,分别于0、3、7、14、21 d经小鼠腹腔给药,0. 5 mL/只。MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测T淋巴细胞表面标记,ELISA法测定小鼠体液中狂犬病病毒抗体IgG(RV-IgG)浓度。结果与Y1组及Y2组比较,Y3组初次免疫后3 d小鼠脾细胞刺激指数(stimulatingindex,SI)值明显升高(P <0. 01);初次免疫后7、14、21、28 d,CD4^+/CD8^+值明显升高(P <0. 05),初次免疫后7、14、21 d,RV-IgG浓度明显升高(P <0. 05)。结论狂犬病疫苗脂质体冻干粉在小鼠体内具有良好的免疫原性,脂质体能提高疫苗免疫原性,延长疫苗的免疫时间,有望开发成为新一代广泛应用的疫苗佐剂。     

以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建

目的构建以乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus coreprotein,HBc)颗粒为载体的含流感病毒M2基质蛋白胞外功能区(M2 ectodomain,M2e)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)保守表位的流感通用疫苗,评价其抗不同亚型流感病毒感染的保护作用。方法采用基因工程方法将流感病毒M2e的3拷贝重复片段与NP的CTL表位串联,插入HBc刺突顶端的免疫优势决定区,构建重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG16℃低温诱导表达。表达的融合蛋白HBc-3M2e-NP经纯化后,电镜观察病毒样颗粒形成情况。纯化的融合蛋白分别经鼻腔和腹腔免疫小鼠,对照组注射等体积的PBS,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平;以流感病毒攻毒,检测融合蛋白的保护效果。结果重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,以包涵体和可溶性两种形式表达,且可与鼠抗M2e单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度大于90%,且能够自动装配成病毒样颗粒。用该病毒样颗粒免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对不同流感病毒毒株的特异性抗体;2种途径免疫的小鼠脾组织中CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例均较对照组明显升高;攻毒试验结果显示,具有交叉保护作用。结论构建的流感通用疫苗能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答及有效的交叉保护作用,为流感通用疫苗的深入研究奠定了基础。