工业蛋白水解酶快速检测方法的建立与初步应用

蛋白水解酶是一类重要的工业酶制剂,快速检测蛋白水解酶活力对新蛋白酶的发现、生产与应用极为重要。基于荧光共振能量转移原理,用氟硼荧荧光素标记大豆分离蛋白,以此为底物建立了一种快速检测蛋白水解酶活力的新方法。运用此方法检测5种工业蛋白酶,酶活在0. 025～0. 4 U/m L与荧光值呈现良好的线性关系,检测限范围为1. 1×10~(-4)～1. 4×10~(-4)U/m L,定量限范围为3. 7×10~(-4)～4. 5×10~(-4)U/m L,相比国标福林法灵敏度提高20 000倍以上。该方法灵敏度高、操作简便,在蛋白水解酶快速、微量检测及新型蛋白水解酶开发中具有应用潜力。     

S．Heidelberg血清型特异性基因筛选及PCR检测方法的建立与应用

海德尔堡沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Heidelberg,SH)是沙门氏菌属内重要的致病性血清型。通过对SH基因组序列进行BLAST比对和PCR验证,筛选出了4个SH血清型特异性基因(SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3259和SeHA_C3258)。以SeHA_C3258作为靶点设计引物pHAm8(350bp)和沙门氏菌属特异性引物139-141(284bp),建立SH的PCR检测方法,并对其应用效果进行评价。结果表明,经55株不同血清型的沙门氏菌和其他常见食源性致病菌证明,该检测体系具有较好的特异性,纯菌菌落灵敏度为6.1×10~2 CFU/mL。以浓度为N×10~5~N×10~1 CFU/mL的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌为干扰菌时,该体系对10~2 CFU/mL的SH检测结果无影响。人工污染SH的牛奶样品,经8h培养,检测限达1.52CFU/mL。该检测方法能快速、准确检测出食品中的SH,有利于在食品安全领域中的应用。     

侧向流动型重组酶聚合酶扩增技术检测食品中大肠埃希氏菌O157

研究内容基于侧向流动型重组酶聚合酶扩增(Lateral flow-based recombinase polymerase amplification,LF-RPA)技术原理,建立大肠埃希氏菌O157(Escherichia coli O157)的LF-RPA快速检测方法。应用该方法对3株大肠埃希氏菌O157和27株非大肠埃希氏菌O157进行检测,结果表明该方法具有良好的特异性。分别以10倍浓度梯度稀释插入靶基因序列的质粒pUC57-rfbE和大肠埃希氏菌O157菌液DNA作为模板进行LF-RPA检测。结果表明LF-RPA方法可检出1.0×10²拷贝/μL的pUC57-rfbE质粒和1.2×10⁴ cfu/mL的大肠埃希氏菌O157菌液。以大肠埃希氏菌O157污染食品样品,增菌4 h后,大肠埃希氏菌O157初始浓度为1.2×10¹ cfu/mL的食品增菌液可以被LF-RPA检出阳性信号。该研究建立的方法可快速、准确、灵敏地检测食品中大肠埃希氏菌O157,无需专业设备,在食品生产企业和基层检测机构具有一定的应用前景。     

实时荧光PCR法鉴定野生食用菌中白牛肝菌成分

目的建立野生食用菌中白牛肝菌(Boletus bainiugan Dentinger)成分的荧光PCR检测方法。方法根据白牛肝菌的内源转录间隔区(internally transcribed spacer,ITS)基因序列设计白牛肝菌物种的特异性引物和探针,对样品中的靶标基因片段进行检测,并进行物种特异性检测、稳定性检测、灵敏度检测和实际应用检测。结果通过对供试的24种食用菌、动、植物材料进行检测,只有白牛肝菌出现特异性扩增,说明方法具有物种特异性;方法对白牛肝菌成分的检测灵敏度为1×10~(-4) ng/μL白牛肝菌DNA或0.1%(m/m)白牛肝菌粉。结论该方法简单、灵敏、快速、准确,能应用于野生食用菌和食品中白牛肝菌的成分检测。     

基于交流电动作用的免疫传感器快速高灵敏检测花生油中的黄曲霉毒素B_1

该文建立了花生油中黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)快速准确的检测方法。利用交流电动作用对AFB_1进行加速和富集,然后在敏感元件微芯片上与固定的抗AFB_1单克隆抗体发生免疫反应从而导致电容规律性变化,构建AFB_1免疫传感器。结果表明,该方法可在30 s内完成加样、孵育和检测,实现对食用花生油中AFB_1的高灵敏度定量分析。该方法针对测试液中AFB_1浓度的线性范围为10~(-6)～10~(-2)μg/m L(R~2=0. 993 6);相对标准偏差(n=5)为6. 63%～15. 60%,最低检出限为2. 01×10-7μg/m L(3σ/S),定量限为2. 35×10~(-7)μg/m L(10σ/S),平均加标回收率为85. 20%～97. 70%,对AFB_2、AFM_1、AFG_1、OTA、DON、ZEN等可能共存毒素具有抗干扰性。     

产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR特异性引物设计和方法验证

目的 建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果。方法 选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,结合滤膜法处理含有plc基因的标准菌株的模拟污染水样,并对所建立的方法进行测试。结果 所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有高度的特异性,13株食源性致病菌、3株艰难梭菌及1株腐败梭菌的Ct值大于40;该方法的最低检出限为1×10 copies/μL,具有较高的灵敏性;对模拟污染水样的最低检测限为1.0×10² CFU/mL。应用该方法对4份人工模拟污染阳性水样与90份自来水样进行检测发现,2份1.0×10² CFU/mL的模拟污染水样可检出产气荚膜梭菌,2份1.0×10 CFU/mL的模拟污染水样与90份自来水样均未检出产气荚膜梭菌。结论 所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏性高的优点,对水体中产气荚膜梭菌的检...     

TMV、CMV和PVY三重荧光定量PCR同步检测方法的建立

为建立同时检测烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重荧光定量PCR方法，本研究根据GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列设计引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了可同时检测TMV、CMV和PVY的三重荧光定量PCR方法，并评价了该方法的敏感性、特异性、重复性及准确性。结果显示，建立的方法中TMV、CMV和PVY的检测下限分别为2.60×10¹、1.25×10¹、2.33×10¹ copies/μL，检测灵敏度比普通PCR法提高10倍；该方法可特异性检测出TMV、CMV和PVY，但烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)无法检出且无交叉反应，批内与批间重复性试验变异系数均小于1.5%,24份样本检测结果中TMV、CMV和PVY的阳性检出率分别为75%、100%和41.67%，且三重荧光定量PCR方法与普通单重PCR方法得出一致的检测结果。结果表明本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、稳定性好、准确性高等优点...     

基于HDA的超级细菌耐药基因NDM-1检测方法的建立

本研究以建立解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成特异性引物,建立和优化了可快速检测该种基因的HDA检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR。提示HDA是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的非PCR核酸扩增技术。     

HPLC法测定发酵乳中γ-氨基丁酸条件的优化

本文优化了乳酸菌发酵乳中γ-氨基丁酸(GABA)的HPLC检测方法。以三氯乙酸-水溶液为提取液,通过60℃水浴、10000 r/min离心10 min等方法去除样品中的杂质,对乳酸菌发酵乳制品中的GABA进行提取。通过调整流动相的洗脱方式、流动相比例与pH、柱温等条件,使用专用氨基酸分析柱、恒温柱温箱、自动进样器和仪器自动衍生程序,建立了一种高效快速检测发酵乳制品中GABA的方法。该方法对GABA的检出限LOD(S/N=3)为0.005μg/mL(质量浓度),定量限LOQ(S/N=10)为0.02μg/mL(质量浓度)。线性范围是0.005~500μg/mL(质量浓度),相关系数R2=1。该方法具有准确度高、快速、环保、经济等特点。采用该方法对功能食品样品、红曲米样品、乳酸菌发酵液样品中的GABA进行检测,均能得到满意的效果,证明该法具有较广泛的适用性。     

基于还原氧化石墨烯修饰玻碳电极的残留氧化乐果和溴氰菊酯电化学快速检测

将还原氧化石墨烯(RGO)分散悬浮后,于玻碳电极(GCE)表面滴涂修饰制成RGO/GCE电极,利用差分脉冲伏安法、循环伏安法对杀虫剂氧化乐果和溴氰菊酯进行快速电化学检测研究。结果表明,该修饰电极对残留农药氧化乐果和溴氰菊酯的氧化-还原反应具有良好的电化学催化作用,在5×10~(-5)~1×10-1mg/kg和1×10-4~5×10~(-1)mg/kg范围内,峰电流分别与氧化乐果和溴氰菊酯的浓度呈良好的线性关系,且氧化乐果的检出限为3×10~(-5)mg/kg,加标回收率范围为88.1%~105.1%,相对标准偏差在3.61%~9.75%之间,而溴氰菊酯的检出限为2×10~(-5)mg/kg,加标回收率范围为85.4%~106.4%,相对标准偏差在2.96%~10.32%之间,均符合GB 2763-2016要求。本方法的灵敏度比该国家标准中气相色谱法检测氧化乐果(检出限0.02 mg/kg)和溴氰菊酯(检出限0.001mg/kg)分别高出3个和2个数量级。基于RGO优异吸附性能和导电能力构建的RGO/GCE法,在痕量杀虫剂氧化乐果和溴氰菊酯的快速检测中具有极其重要的意义。     

肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立

将荧光染料叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide,EMA）与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50 μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。     

Detection of viable Salmonella in lettuce by propidium monoazide real-time PCR

Contamination of lettuce by Salmonella has caused serious public health problems. Polymerase chain reaction (PCR) allows rapid detection of pathogenic bacteria in food, but it is inaccurate as it might amplify DNA from dead target cells as well. This study aimed to investigate the stability of DNA of dead Salmonella cells in lettuce and to develop an approach to detecting viable Salmonella in lettuce. Salmonella-free lettuce was inoculated with heat-killed Salmonella Typhimurium cells and stored at 4 °C. Bacterial DNA extracted from the sample was amplified by real-time PCR targeting the invA gene. Our results indicate that DNA from the dead cells remained stable in lettuce for at least 8 d. To overcome this limitation, propidium monoazide (PMA), a dye that can selectively penetrate dead bacterial cells and cross-link their DNA upon light exposure, was combined with real-time PCR. Lettuce samples inoculated with different levels of dead or viable S. Typhimurium cells were treated or untreated with PMA before DNA extraction. Real-time PCR suggests that PMA treatment effectively prevented PCR amplification from as high as 10(8) CFU/g dead S. Typhimurium cells in lettuce. The PMA real-time PCR assay could detect viable Salmonella at as low as 10(2) CFU/mL in pure culture and 10(3) CFU/g in lettuce. With 12-h enrichment, S. Typhimurium of 10(1) CFU/g in lettuce was detectable. In conclusion, the PMA real-time PCR assay provides an alternative to real-time PCR assay for accurate detection of Salmonella in food.     

细菌活的非可培养状态的分子生物学检测技术研究进展

许多细菌在不良环境下能进入活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)。细菌培养技术常常造成VBNC状态的细菌漏检,应用分子生物学检测技术可以提高VBNC细胞的阳性检出率。针对VBNC细胞的分子生物学检测技术,基于细菌特异性DNA分子、mRNA分子是目前常用的检测方法,而利用报告基因(如绿色荧光蛋白基因)检测VBNC细胞是一种有效的方法。最近利用叠氮溴乙锭 (ethidium monoazide bromide,EMA)或者叠氮溴化丙锭 (propidium monoazide,PMA)联合PCR技术选择性抑制细菌死细胞扩增,该方法结合了EMA(PMA)选择渗透性和PCR特异性,作为一种区分细胞死活的方法,可以有效检测细菌VBNC细胞。     

肠炎沙门氏菌的LAMP检测方法的建立

建立肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对肠炎沙门氏菌的快速检测.通过针对肠炎沙门氏菌血清型特异性基因lygD设计LAMP内外引物对,优化LAMP扩增反应条件,采用包括肠炎沙门氏菌在内的10种不同菌株进行LAMP引物特异性检测;通过系列梯度稀释肠炎沙门氏菌菌液进行LAMP扩增,计算检出限;并对鲜鸡蛋模拟样本进行LAMP检测.结果表明LAMP法可快速特异地检测出肠炎沙门氏菌;细菌培养液检出限为2.33×101 cfu/mL,鲜鸡蛋模拟样品为2.67×l01cfu/mL.该方法反应灵敏度高,可用于食品中肠炎沙门氏菌的快速检测.     

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。     

实时荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌活菌

沙门氏菌是引起食物中毒的最常见致病菌,而基于DNA水平的常规PCR(DNA-PCR)检测法虽然快速、灵敏,但在检测时无法区分死活菌,死亡的细菌会出现假阳性结果,严重影响日常检测结果的判断。提取沙门氏菌总RNA之后,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以沙门氏菌invAmRNA为检测对象,发现只有活的沙门氏菌显阳性,死亡的沙门氏菌呈阴性。而且RT-PCR法的稳定性良好,能够准确定量活的沙门氏菌,在纯培养时,检出限可达1CFU/3mL。实验表明,建立的RT-PCR法是一种能够快速、精确检测沙门氏菌活菌的方法。     

二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法。结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分。建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。     

EMA-PCR法快速检测啤酒中腐败短乳杆菌

将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓度小于20μg/m L时,对活的短乳杆菌中靶基因的扩增没有明显抑制作用;而当EMA终质量浓度为1.0μg/m L时可有效抑制10~5 CFU/m L短乳杆菌死细胞的扩增。本实验建立的EMA-PCR检测方法的灵敏度为10~4活细胞/m L酒液样品。验证实验结果表明,在13株乳酸菌中,建立的hor C特异性EMA-PCR能有效检测到其中的全部5株啤酒污染菌,同时可区分这5株菌的活/死细胞混合体系,降低检测过程中的假阳性。     

应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究

建立环介导等温扩增技术(Loop-medisothermalamplification,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列中的保守区域设计了4条特异性引物,在65℃等温条件下,45min即可扩增出梯形条带.LAMP检测金黄色葡萄球菌纯培养物的...