基于培养基法和高通量测序法分析冷藏小龙虾优势腐败菌

为揭示4 ℃冷藏小龙虾贮藏期间微生物菌群多样性及优势腐败菌种类,以传统培养基法作为对照,采用高通量测序技术分别鉴定小龙虾样品在鲜样期、腐败中期、腐败末期的腐败菌属,探究贮藏期间微生物菌群变化趋势。2 种测序方法对比发现,高通量法检测到的菌属更具多样性,培养基法提取的腐败菌均包含在高通量测序菌属内。结果表明,培养基法提取优势腐败菌共11 株,其中气单胞菌（Aeromonas jandaei）致腐能力最强,弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）致腐能力最弱;此外,高通量测序法显示希瓦氏菌（Shewanella sp.）、肉杆菌属（Carnobacterium sp.）、环丝菌属（Brochothrix sp.）、嗜冷菌属（Psychrobacter sp.）、漫游球菌属（Vagococcus sp.）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）等在腐败末期时的物种丰度为90.57%。2 种方法比对可以确定,小龙虾的优势腐败菌有希瓦氏菌、肉食杆菌、环丝菌属、嗜冷菌属、漫游球菌属、不动杆菌属、气单胞菌、束毛球菌属（Trichococcus sp.）等。     

冷藏海鲈鱼优势腐败菌的筛选和鉴定

分离鉴定4 ℃冷藏条件下海鲈鱼的优势腐败菌,通过选择性培养基筛选获得单一菌株,对各菌株进行致腐能力的测定,确定冷藏海鲈鱼的优势腐败菌。对冷藏海鲈鱼的优势腐败菌进行菌落形态观察及部分生理生化实验、16S rDNA分子鉴定。结果表明,有4 株冷藏海鲈鱼优势腐败菌,其中1 株为草莓假单胞菌（Pseudomonas fragi）,1 株为腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）,其余2 株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。在4 ℃冷藏条件下,草莓假单胞菌的致腐能力最强,其次是腐败希瓦氏菌和假单胞菌。     

冷藏小龙虾优势腐败菌的筛选鉴定及细菌群落结构和多样性分析

以4℃贮藏小龙虾货架期终点筛选武汉孝感小龙虾中优势腐败菌,同时结合高通量测序方法,进一步确定小龙虾中优势腐败菌,并对小龙虾贮藏过程中菌相变化、微生物结构及其多样性进行分析。结果表明：传统培养法从腐败小龙虾中共筛选出10 株腐败菌,包括波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）等;在属水平上,高通量测序法最终确定气单胞菌属（Aeromonas sp.）及希瓦氏菌属（Shewanella sp.）是小龙虾腐败末期相对丰度最大的2 种优势腐败菌;同时,高通量测序结果表明,随着贮藏时间的延长,小龙虾微生物群落丰富度、多样性及均匀度不断下降,这与腐败末期优势腐败菌的大量增长及生长繁殖过程中抑制其他种类微生物有关。     

PCR-DGGE法结合传统技术研究4℃冷链贮运条件下三文鱼菌相变化

为研究三文鱼在冷链贮运4 ℃条件下的细菌腐败机制,运用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）技术、传统鉴定技术以及PCR技术分析了4 ℃冷链贮运条件下的三文鱼中腐败菌菌相变化规律,并通过产量因子测得各优势菌株致腐能力,从而确定特定腐败菌。DGGE指纹图谱显示,贮藏期间微生物多样性降低,假单胞菌属和希瓦氏菌属条带亮度却逐渐提高。这表明这两个属的微生物在三文鱼冷藏期间逐渐成为优势菌。通过分离和鉴定贮藏末期腐败三文鱼的优势腐败菌,本实验得到5 株优势腐败菌,分别为麦芽糖肉食杆菌（Carnobacterium maltaromaticum LMA28）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. syringae B728a）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens SBW25）、肉食杆菌（Carnobacterium sp. WN1359）和波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica OS678）。将这5 株纯培养的腐败菌分别接种到无菌三文鱼中并冷藏一定时间后,各腐败菌的挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）产量因子分别为1.26×10－7、1.25×10－7、1.36×10－7、1.08×10－7 mg TVB-N/CFU和1.03×10－7 mg TVB-N/CFU。这5 株腐败菌对三文鱼致腐败能力的顺序依次为荧光假单胞菌SBW25＞麦芽糖肉食杆菌LMA28＞丁香假单胞菌B728a＞肉食杆菌WN1359＞波罗的海希瓦氏菌OS678。     

冷海水保藏下鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)菌相变化规律及优势腐败菌的分离鉴定

以冷海水保鲜的鲐鱼为研究对象,通过选择性培养基和16S r DNA序列分析法探究其在冷海水保鲜过程中的菌相变化,确定了鲐鱼在冷海水保鲜条件下的优势腐败菌,并通过MEGA5.2软件构建了贮藏末期代表菌株的系统发育树。结果表明:冷海水保鲜鲐鱼样品在贮藏初期(第0 d)的微生物比较复杂,优势种群是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和嗜冷菌属(Psychrobacter sp.),还有少量的类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌属(Brevibacterium sp.);随着贮藏时间的延长,鲐鱼样品中的菌相逐渐变的单一,假单胞菌属迅速下降,希瓦氏菌属迅速增加;贮藏末期希瓦氏菌属和肠杆菌属(Enterobacter sp.)的比例迅速增加,其中希瓦氏菌属呈上升趋势且到贮藏后期数量占绝对优势,被确定为鲐鱼冷海水保鲜条件下的优势腐败菌。     

0℃贮藏卵形鲳鲹货架期的研究及特定腐败菌的分离与鉴定

为研究0℃贮藏卵形鲳鲹的货架期,并分离鉴定其特定腐败菌,以0℃贮藏卵形鲳鲹为研究对象,监测其感官品质、菌落总数、TVB-N值的变化以确定其保质期,采用传统选择性培养基法结合16S r DNA技术,研究了卵形鲳鲹的菌落特征、分离与鉴定腐败菌,并以腐败物质的产量因子(Y_(TVB-N/cfu))为评价标准,定量测定了贮藏末期优势菌的致腐能力。结果表明:0℃贮藏下9 d后卵形鲳鲹的感官品质、货架期达到终点;贮藏末期(9 d)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens23.61%)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus 20.06%)、草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi 17.03%)、沙门氏菌(Salmonella enteric 11.62%)和大肠杆菌(Escherichia coli 10.53%)数量占绝对优势,通过对贮藏末期5株数量优势菌的致腐能力测定发现,荧光假单胞菌致腐能力最强(产量因子:4.66×10~(-8)mg TVB-N/cfu),蜡样芽孢杆菌(3.73×10~(-8) mgTVB-N/cfu)和草莓假单胞菌(3.53×10~(-8) mgTVB-N/cfu)次之,大肠杆菌(2.61×10~(-8) mgTVB-N/cfu)和沙门氏菌(2.46×10~(-8) mgTVB-N/cfu)最弱,综合比较,最终确定荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌以及草莓假单胞菌为0℃贮藏下卵形鲳鲹的特定腐败菌。     

鲐鱼冷海水贮藏期间特定腐败菌的鉴定

将新鲜鲐鱼贮藏在冷海水系统中,采用选择性培养基和16S rDNA序列分析法,研究贮藏期间菌相变化以确定优势腐败菌。通过对优势腐败菌致腐能力的测定,确定鲐鱼冷海水贮藏的特定腐败菌。结果表明,贮藏期间鲐鱼的主要菌相由嗜冷杆菌过渡到假单胞菌,再到希瓦氏菌。腐败样品中的菌相主要由希瓦氏菌、肠杆菌和柠檬酸杆菌组成,致腐能力试验结果表明,接种希瓦氏菌可以导致样品中挥发性盐基氮(TVB-N)、三甲胺(TMA)和菌落总数快速增加;柠檬酸杆菌和样品组胺的产量相关性较强。由于接种柠檬酸杆菌的样品菌落总数始终处于较低水平,因此确定希瓦氏菌为鲐鱼在冷海水贮藏条件下的特定腐败菌。     

冷藏鲈鱼片优势腐败菌的分离鉴定及致腐能力分析

为研究冷藏鲈鱼贮藏末期的优势腐败菌及其致腐能力,采用选择性培养基获得鲈鱼贮藏末期的特定菌落,结合感官分析确定所筛菌株中的优势腐败菌。通过多次划线分离获得纯菌株,结合菌落形态观察、传统生理生化试验与16S rDNA技术,确定所筛菌株属种,并将所鉴定的优势腐败菌接种至无菌鲈鱼样品上,在4℃条件下贮藏,测定不同贮藏时间段的挥发性盐基氮(TVB-N)与菌落总数,以TVB-N产量因子(YTVB-N)衡量各腐败菌的致腐能力。结果得出,筛选获得的5株菌株中,有假单胞菌属P1(WCS374)1株,草莓假单胞菌P2(P121)与P3(B-727)2株、希瓦式菌属S1与S2(OS185)2株。其致腐能力排序为S1S2P2P3P1,其中腐败希瓦式菌属细菌S1的致腐能力最强。由产量因子分析表明,草莓假单胞菌P2的致腐能力强于一般假单胞菌属细菌P1与P3。经综合比较,鲈鱼鱼肉中希瓦式菌属细菌的致腐能力强于假单胞菌属细菌。     

冰鲜银鲳鱼优势腐败菌的分离鉴定及其致腐能力分析

分离鉴定冰鲜银鲳中的优势腐败菌并测定其致腐能力的大小。通过传统平板分离纯化方法,从腐败菌的菌落特征、革兰氏染色及生理生化试验和16S r DNA部分序列鉴定来确定其菌属。将分离得到的腐败菌株转接至灭菌鲳鱼肉中,通过测定各腐败菌的菌落增长数和挥发性盐基氮(TVBN)的值,并以TVB-N产量因子(YTVB-N/CFU)衡量各腐败菌的致腐能力。结果表明:经分离筛选得到4株优势腐败菌,其致腐能力1号3号2号4号,经过鉴定1号菌为Pseudomonas fluorescens,2号菌为Lysinibacillus sphaericus,3号菌Shewanella sp,4号菌为Microbacterium oxydans。     

优势腐败菌对暗纹东方鲀冷藏期间品质变化影响及致腐能力分析

为分析暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)优势腐败菌的不同接种方式对其冷藏期间品质变化影响及致腐能力.将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)分别以单一和联合法接种到无菌整鱼上,依次分为荧光假单胞菌接种(P.fluore...     

不同时期鲳鱼冷藏期间优势腐败菌的多样性变化

目的：比较分析不同时期冷藏鲳鱼（Pampus argenteus）贮藏期间的感官品质、pH值、微生物指标与主要微生物菌群的变化规律。方法：冷藏（4±1） ℃条件下,以感官评定、pH值与菌落总数为品质评价指标,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增结合生理生化鉴定法分别对冬、春两个时期的鲳鱼进行优势腐败菌的变化规律研究。将经细菌培养与分离纯化得到单菌落按其形态特征进行分类,再通过生理生化鉴定与革兰氏染色,初步得到菌落种类,对单菌落进行DNA提取与PCR扩增并测序。结果：冬季样品获得12 种菌株,春季样品获得9 种菌株。贮藏末期时,冬季样品中优势腐败菌的种类与比例分别为嗜冷杆菌（Psychrobacter spp.）21.51%、草莓假单胞菌（Pseudomonas fragi）16.13%、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）52.68%与热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）9.68%;春季样品为草莓假单胞菌（Pseudomonas fragi）8.62%、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）64.66%与腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）26.72%。结论：冬、春时期中冷藏鲳鱼贮藏期间优势腐败菌的种类基本一致,以革兰氏阴性菌为主,但在细菌种类与比例上存在差异,冬季样品的微生物种类较春季丰富。贮藏期间,随着荧光假单胞菌所占比例的增加,使腐败希瓦氏菌的生长受到明显抑制。     

冷藏鲤鱼和罗非鱼优势腐败菌腐败能力分析

通过分析接种腐败菌的鲤鱼和罗非鱼无菌鱼块贮藏中感官、腐败代谢产物和腐败菌的变化,以腐败菌的生长动力学参数和腐败代谢产物的产量因子(YTVBN/CFU)为指标,探讨冷藏鲤鱼和罗非鱼优势腐败菌假单胞菌和腐败希瓦氏菌的腐败能力。结果表明:接种腐败希瓦氏菌和恶臭假单胞菌的鲤鱼无菌鱼块的货架期分别为132h和162h,此时的TVBN值为27.12mg/100g和22.51mg/100g,腐败希瓦氏菌和恶臭假单胞菌菌数为8.96 lg(CFU/g)和9.07 lg(CFU/g),产量因子YTVBN/CFU为9.28×10-9mg TVBN/CFU和1.81×10-8mg TVBN/CFU。接种荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌的罗非鱼无菌鱼块的货架期分别为132h和144h,此时的TVBN值为23.46mg/100g和24.30mg/100g,荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌菌数为8.83 lg(CFU/g)和9.12 lg(CFU/g),产量因子YTVBN/CFU为1.67×10-8mg TVBN/CFU和9.10×10-9mg TVBN/CFU。结合两种养殖鱼冷藏过程中的菌相变化和腐败菌在腐败过程中的作用,初步得出冷藏罗非鱼和鲤鱼的特定腐败菌是假单胞菌,两种腐败菌都具有较强的腐败能力。     

大黄鱼中复合腐败菌腐败能力的分析

通过分析接种腐败菌的大黄鱼无菌鱼块在贮藏中的感官、腐败代谢产物和腐败菌的变化,以腐败菌生长动力学参数和腐败代谢产物产量因子(YTVB-N/CFU 和YTMA/CFU)为指标,探讨冷藏大黄鱼优势腐败菌(腐败希瓦氏菌、假单胞菌以及这两种菌的复合菌)的腐败能力。结果表明,接种腐败希瓦氏菌、假单胞菌和复合菌的无菌鱼块的货架期分别为168、174、168h,说明接种假单胞菌的货架期较长。腐败希瓦氏菌、假单胞菌和复合菌的YTVB-N/CFU 基本一致,腐败希瓦氏菌的YTMA/CFU 明显大于假单胞菌和复合菌,腐败希瓦氏菌的腐败能力较假单胞菌和复合菌强。假单胞菌对腐败希瓦氏菌的生长有一定的拮抗作用,但仅在较高数量时才有明显作用,腐败希瓦氏菌是有氧冷藏养殖大黄鱼的特定腐败菌。     

冷藏秋刀鱼的菌相分析及其优势腐败菌的分离鉴定

冷藏秋刀鱼优势腐败菌的研究可为靶向抑菌,延长货架期提供一定的参考。论文利用传统培养的方法研究了冷藏(4℃)秋刀鱼的菌相变化、分离与鉴定优势腐败菌并验证了其腐败能力。结果表明,秋刀鱼冷藏6 d后达到其货架期终点,冷藏过程中共分离、鉴定出13株细菌,革兰氏阳性菌7株,革兰氏阴性菌6株,分属7个菌属。根据各菌株在菌相中的比例变化及对灭菌鱼汁TVB-N值的影响,可以确定菌株13(肠杆菌),12(希瓦氏菌),7、9(不动杆菌)为冷藏秋刀鱼的优势腐败菌。各株优势腐败菌对秋刀鱼挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)、三甲胺(trimethylamine,TMA)、硫代巴比妥酸(the 2-2-thiobarbituric acid,TBA)的影响不同,12号菌株(希瓦氏菌)会加速样品TMA的产生,13号菌株(肠杆菌)对样品的TVB-N值影响最大,7号菌株(不动杆菌)则会促使样品的TBA值显著增大,9号菌株(不动杆菌)对以上各指标也均具有一定的影响,证明所确定的4株菌对冷藏秋刀鱼具有较强的腐败能力。     

肉制品中亚硝酸盐测定能力验证

为加强肉制品安全监督管理,进一步提升检验检测机构对肉制品中亚硝酸盐含量的检测能力,确保提供的检测数据准确、可靠,组织实施肉制品中亚硝酸盐含量检测能力验证计划。制备含亚硝酸钠的鸡肉火腿肠,向42家实验室随机发放样品,在规定时间内回收检测数据。对检测结果进行稳健统计分析,以Z值评价各个实验室的检测能力,并对非满意结果的实验室通过查阅原始记录进行技术分析。结果表明：制备的能力验证样品均匀、稳定,满足能力验证计划要求;42家实验室总体结果满意率为81.0%,表明实验室对肉制品中亚硝酸盐含量的检测能力较好;部分实验室发现检测过程中所存在的问题,并加以改正,使自身检测能力进一步提高。     

凡纳滨对虾腐败优势菌的分离鉴定及其群体感应信号分子测定

从凡纳滨对虾中分离和鉴定腐败优势菌,并对其进行群体感应信号分子AHLs和AI-2的测定。通过细菌自动生化鉴定系统和16S rDNA序列鉴定优势腐败菌;利用生物检测菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1测定其AHLs、哈维弧菌（Vibrio harveyi）BB170检测其AI-2,并探究其动态生成规律。最终分离得到10 株腐败优势菌,有4 株菌均为变形杆菌属（Proteus）,其他分别为Oceanisphaera profunda、溶血性葡萄球菌（Stapylococcushaemolyticus）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短杆菌属（Brevibacterium）、Bacillus siamensis、Exiguobacterium aaestuarii。分离腐败优势菌中的6 株革兰氏阴性菌均产生AHLs信号分子;变形杆菌属、腐败希瓦氏菌、短杆菌属、Bacillus siamensis产生AI-2信号分子。优势腐败菌的AHLs活性与菌体生长密度呈正相关,AI-2产生量在菌体生长对数期累积,在菌体生长24 h后活性迅速减弱。     

冷鲜牛肉贮藏中菌群结构及优势菌致腐性的分析

为探究牛肉在0?℃冷藏下微生物菌群变化和优势腐败菌,采用培养依赖的16S rRNA结合高通量测序技术分析牛肉样品的微生物多样性变化。通过定期测定接种牛肉汁的生长、感官、蛋白酶活性、pH值和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）值,分析分离株的致腐特征。结果表明,牛肉冷藏中感官品质保持良好,15?d出现异味,18?d有腐臭味。而样品中菌落总数第3天快速上升,15?d菌落总数为8.73（lg（CFU/g））,之后呈现稳定,假单胞菌（Pseudomonas spp.）、热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）、肠杆菌（Enterobacter）和乳酸菌4 种分离培养基中细菌与菌落总数增长趋势相似,其中假单胞菌增长最快,肠杆菌数和乳酸菌数生长最慢。两种菌群鉴定结果显示,冷鲜牛肉初始微生物构成复杂,包括热死环丝菌、不动杆菌属（Acinetobacter spp.）、气单胞菌属（Aeromonas spp.）和假单胞菌等多种菌属构成,而腐败末期菌群构成趋于单一,假单胞菌和热死环丝菌为优势腐败菌,特别是莓实假单胞菌（P. fragi）。将腐败分离株10?株假单胞菌、4?株热死环丝菌和1?株蜂房哈夫尼菌（Hafnia alve）接种于冷藏的牛肉汁,发现假单胞菌和蜂房哈夫尼菌的接种组感官评分、pH值和TVB-N值高于热死环丝菌,且假单胞菌有较强的蛋白酶活性。研究表明,结合感官和微生物评价冷鲜牛肉贮藏期为15?d,且菌群多样性下降,假单胞菌和热死环丝菌是优势腐败菌,其中假单胞菌致腐性较强。