雨生红球藻等离子诱变及高产藻株的筛选

目的通过等离子体诱变筛选获得高产虾青素的雨生红球藻突变株。方法将常压室温等离子体应(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)用于雨生红球藻的诱变育种处理。ARTP在常温下以输入功率100 W、处理距离2mm、气体流速10 L/min处理雨生红球藻40s,雨生红球藻的致死率达90%以上。在此条件下获得诱变株后,以虾青素合成抑制剂作为筛选剂,成功筛选获得一株虾青素高产藻株M45。结果该突变株的生物量和生长速率分别较出发株提高了6.45%和8.57%。突变株M45的虾青素含量达3.1%,较出发株提高了51.96%;虾青素产量为71.92 mg/L,相比于出发株提高了61.73%,且遗传稳定性实验表明,M45生产性能稳定。结论经等离子体诱变获得的突变株M45虾青素含量高,生产性能稳定,具有一定的工业应用前景,等离子体诱变方法适用于雨生红球藻的育种。     

不同温度下雨生红球藻优良藻株筛选

为获得适宜大规模培养的藻株,研究和比较了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)3个不同品系分别在15、20、25、30℃中的生长和虾青素积累情况。结果表明,温度对雨生红球藻的生长和虾青素积累有显著的影响,并且与藻种品系有关。各培养温度下,雨生红球藻藻株H3的细胞密度、藻细胞干重、虾青素含量和产量具有明显优势。藻株H3的最适生长温度为15℃,其最终细胞密度和细胞干重分别为11.75×10~4 cell/mL和0.337 g/L,但该条件不利于虾青素的积累;虾青素积累在20℃培养时最高,其虾青素含量和产量分别为1.15%、3.41 mg/L;而在30℃时生物量和虾青素产量均最低。因此,优先选择H3作为大规模培养的藻种。     

雨生红球藻高产虾青素的培养条件优化

本研究从5种培养基中筛选出最适于雨生红球藻HP1藻株绿色细胞生长阶段细胞增殖的培养基,并针对筛选出的培养基分别进行有机碳源和无机碳源及其浓度的优化。在此基础上,以光照强度、初始p H值和诱导时间为实验因素,采用单因素试验、中心点复合设计(CCD)响应面法对雨生红球藻虾青素积累阶段的胁迫条件进行优化。结果表明:HP1藻株在配方A及OHM培养基中均能达到较高生物量,有机碳源和无机碳源的最优浓度均为0.5 g/L。HP1虾青素积累的最优胁迫条件为:光照145μmol/m~2·s,初始p H 7.0,诱导时间9 d。在上述条件下,以有机碳源(NaAC)和无机碳源(NaHCO_3)为碳源的培养体系中,虾青素产量最大分别为5.74 mg/L、4.25 mg/L。研究结果将为进一步提高雨生红球藻虾青素产量提供科学依据。     

雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨

探讨了雨生红球藻(Haematoccuspluvialis)712株的适宜培养条件及藻体诱导累积虾青素的培养基条件。重点研究了温度、pH和光照条件对雨生红球藻营养生长的影响,以及NaNO3、Fe2+盐和乙酸钠浓度对雨生红球藻诱导累积虾青素含量的影响。结果表明:24℃、1000～1500lx连续光照、pH8.0左右的生长条件适合雨生红球藻游动细胞增殖,使平均生长速率达到0.252/d。通过正交试验表明:缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利,虾青素含量达到6.72μg/mL,而FeSO4和乙酸钠浓度对虾青素的累积无显著性影响。     

高产虾青素的雨生红球藻胁迫条件和中试研究

探究雨生红球藻在不同培养条件和规模下积累虾青素的情况,结果表明在缺氮、光强6 000~8 000Lux、装液量100 m L/500 m L三角瓶的条件下虾青素含量可达藻细胞干重的(4.20±0.19)%,质量浓度为(59.23±2.13)mg/L。平板式光照生物反应器中试实验表明,绿色营养阶段在室内和半室外培养时,培养液中的生物量可达到0.88 g/L与1.04 g/L,进入稳定期前生产率分别为0.048 5 g/(L·d)和0.057 1 g/(L·d),红色胁迫阶段在半室外的培养条件下生物量可达到1.17 g/L,藻细胞中虾青素含量为1.49%,单位体积虾青素产量为17.49 mg/L,虾青素生产率为1.05 mg/(L·d)。     

光照强度对雨生红球藻细胞生长和虾青素积累的影响

初步研究了不同光照强度(40~200μmol/m2·s)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)细胞生长及虾青素积累的影响。结果表明,雨生红球藻在培养初期细胞干物质积累较少,虾青素含量较低;而在整个培养后期细胞干物质积累较多,虾青素含量较高。细胞生长进入对数生长期的时间随光照强度增加而减少。中等光照强度条件(80μmol/m2·s)最适于藻细胞生长,该条件不利于虾青素的积累;而高光强条件(200μmol/m2·s)明显抑制藻细胞生长(P<0.05),但虾青素含量明显提高(P<0.05);继续增加光照强度(240μmol/m2·s),单个细胞中的虾青素含量显著增加。     

黄腐酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)虾青素积累的影响

通过形态学以及18S r RNA的分析,筛选鉴定出了一株新的雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU,并以其作为研究对象,研究了不同质量浓度的黄腐酸(FA)对胁迫培养条件下细胞生长和虾青素产量的影响。结果表明,5 mg/L和10 mg/L的FA不仅促进了藻细胞的生长(生物量浓度分别比对照组增加了4.26%和10.58%),而且能够显著提高虾青素的含量(最大含量分别达到20.82和12.23 mg/L)。其中,5 mg/L的FA诱导效果最为明显,虾青素产量(37.46 mg/g)比对照组(20.90 mg/g)提高79.23%。实验表明,黄腐酸在适当浓度下能够显著促进藻细胞内虾青素的积累,可作为一种有效的诱导子应用于虾青素的生产。     

应用HMG-CoA还原酶抑制剂筛选虾青素高产突变株

研究了HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀对法夫酵母生长及其虾青素合成的影响,实验结果表明,当辛伐他汀浓度在4·78×10-6mol/L时对酵母细胞的生长的抑制表现不明显,但对虾青素合成具有显著的抑制作用。以此浓度作为筛选浓度,经亚硝基胍(NTG)诱变后,通过辛伐他汀平板初筛与摇瓶复筛,获得较高虾青素产率的突变株。实验结果表明,菌体生物量、类胡萝卜总量和虾青素产量都有明显的提高,其中NPX-3_05突变株类胡萝卜总量与虾青素产量分别达到3·823、2·755mg/L,比出发菌株依次提高了163%、143%(1·453mg/L、1·134mg/L)。菌株NPX-3_05经连续发酵5次的稳定性实验表明其性状稳定。目标产物经HPLC定性分析,确定为反式虾青素。因此,以辛伐他汀等HMG-CoA还原酶抑制剂作为选择压力,对虾青素高产突变株的筛选上具有较好的“筛分”能力。     

雨生红球藻物理破壁法提取虾青素研究

研究了几种常用的物理破壁法对雨生红球藻厚壁孢子细胞破壁率及虾青素提取率的影响,确定了高压均质处理、超声波法和反复冻融法的最适工艺条件。试验结果表明:高压均质处理最适合于雨生红球藻厚壁孢子的破碎和虾青素的提取。高压均质的优化条件为:40MPa,室温,循环3次,破壁率可达91.4%,虾青素提取率为28.02μg/mg(细胞干重),而未经破壁的虾青素提取率仅为17.92μg/mg(细胞干重),提取率提高了56.3%。     

响应面分析法优化雨生红球藻产虾青素培养基

通过单因素试验确定雨生红球藻细胞转化产虾青素培养基中乙酸钠、硝酸钾和磷酸二氢钾的较佳质量浓度范围。研究表明,磷酸二氢钾对雨生红球藻产虾青素的影响不大,而乙酸钠和硝酸钾含量对虾青素产量影响较显著。利用响应面法优化,得到乙酸钠1.460 5 g/L,硝酸钾0.008 4 g/L。优化后虾青素产量从0.977 4 mg/L提高到10.908 mg/L,提高了9.16倍。     

茴香醚对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)虾青素积累的影响

利用不同诱导条件促进雨生红球藻Haematococcus pluvialis积累虾青素已成为虾青素生产和研究的热点。实验研究了不同质量浓度的茴香醚(BHA)对胁迫培养条件下雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU生长和虾青素积累的影响。结果表明,2 mg/L的BHA能够显著提高虾青素的含量,最大含量可达29.03 mg/g,比对照组(14.30 mg/g)提高到2.03倍。而在相同的茴香醚诱导条件下,初始藻细胞的不同生长状态对细胞的生长及虾青素的合成也有很大的影响:处于对数生长期后期(14 d)的细胞更有利于虾青素的积累,其最大虾青素含量达到29.3 mg/g,分别比前期、中期和稳定期提高到2.9、1.01和1.72倍。实验表明茴香醚是虾青素诱导的有效诱导子,本研究也可为两阶段法诱导生产虾青素提供依据。     

红发麸酵母虾青素高产菌株的选育

该实验主要是将一株野生型红发麸酵母菌进行分批的抗霉素Ａ和ＥＭＳ诱变，将诱变所得的菌株进行发酵培养，将发酵液进行菌体收集、细胞破碎、有机物抽提，然后用光密度分析法在４７４ｎｍ处进行测定，从中筛选出虾青素产量较高的菌株，即为所得虾青高产菌株３．１４９。     

外源乙烯利对雨生红球藻中虾青素积累的影响

本实验初步研究了一定浓度范围的乙烯利对雨生红球藻积累虾青素的影响。在对数生长期的藻液中分别加入一系列不同浓度的乙烯利溶液,然后转入胁迫培养(25℃,24h5000lux连续光照+营养盐饥饿),诱导细胞内虾青素的合成积累。在诱导过程中显微观察不同浓度乙烯利处理后细胞形态和色素积累的变化,并定期取样进行虾青素含量的测定。结果表明,添加0.05ml/L的乙烯利可以促进雨生红球藻积累虾青素,处理后的藻细胞比对照组的藻细胞提前17d完全变红,虾青素产量比对照提高了92.1%,达18.6mg/L藻液。另外还发现0.1ml/L的乙烯利对雨生红球藻积累虾青素有明显的抑制作用。高浓度的乙烯利(≥0.15ml/L)处理对雨生红球藻细胞存在致死作用。     

粘红酵母虾青素高产菌株的选育及小试产品的应用

该研究主是将一株野生型粘红酵母菌分别进行抗霉素Ａ和ＥＭＳ诱变,将诱变所得菌株进行发酵培养,将发酵液进行菌体收集,细胞破碎,有机溶剂抽提,然后用光密度分析法在４７４ｎｍ处进行测定,从中筛选出虾青素产量较高的菌株Ｂ－７,即为所得虾青素高产菌株。Ｂ－７菌株经扩大培养、提取,获得的虾青素添加剂,在对虾养殖和蛋鸡饲养中做饲养实验,获得了理想的饲养效果。     

高产虾青素红法夫酵母的选育和工艺优化

虾青素是目前世界上公认的一种抗氧化性能最强的抗氧化剂,研究表明:天然虾青素具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等重要的生理功能,而且对人体绝对安全无害,因此,在水产养殖、饲料、食品和医药工业中得到广阔的应用。本文通过两轮紫外诱变和光复活交替处理的方法,诱变选育虾青素的高产菌株,最终获得3株高产菌株;诱变菌株产虾青素的能力相对于原始菌株提高了46%。在筛选高产菌株的基础上,进一步又对其发酵工艺进行了优化,红法夫酵母的最佳培养条件为葡萄糖15g/L,酵母浸粉7.5g/L,磷酸二氢钾2.5 g/L,氯化钙3 g/L,硫酸镁0.5 g/L;在50L发酵罐中培养72h,最终虾青素的产量基本稳定在70mg/L左右。     

人工调控雨生红球藻积累虾青素的研究进展

红球藻是富含营养价值和药用价值的藻类食品.雨生红球藻是自然界中生产天然虾青素的理想来源,虾青素作为一种高效的纯天然抗氧化剂,在清除自由基、抗衰老、抗肿瘤和免疫调节等方面显示出良好的生物活性.利用雨生红球藻生产虾青素具有广阔的发展前景,已成为近年来国际上研究的热点.此外,天然虾青素产量有限,大部分虾青素都是人工调控生产的...     

雨生红球藻中虾青素含量快速测定方法

雨生红球藻中虾青素以虾青素单酯、二酯以及少量游离虾青素的形式存在,为了准确测定虾青素含量,通常需要将提取的虾青素酯水解转化为游离虾青素,再利用HPLC进行定量,操作耗时,不利于生产过程的快速监测。基于系统研究分光光度法直接测定细胞提取物中的混合虾青素含量和提取-酶解-HPLC法测定的关系,发现分光光度法估算的虾青素含量与HPLC法测定的准确含量之间具有良好的线性关系(r2=0. 997)。基于此建立了雨生红球藻虾青素快速测定方法,并对提取条件进行了优化。雨生红球藻粉(约5 mg)利用1 m L二甲基亚砜和6 m L丙酮进行1次提取,准确定容后,测定474 nm处的吸光度,根据吸光度与HPLC法虾青素含量间线性关系计算雨生红球藻中虾青素的含量。该方法操作简单,仅需10～20 min,测定准确,适于生产和流通环节的所需要的快速测定领域。     

微生物法生产虾青素的研究进展

虾青素是一种萜烯类不饱和化合物,具有很强的抗氧化活性,同时还具有抗癌、增强免疫、护眼、保护心脑血管等其他诸多生理功能。天然虾青素主要来源于藻类、酵母以及海洋生物中。目前应用于市场的虾青素主要包括雨生红球藻虾青素、酵母虾青素以及化学合成虾青素。雨生红球藻的培养时间长,生长条件要求苛刻,使得虾青素价格昂贵;化学合成虾青素为混合构型虾青素,抗氧化能力低于天然虾青素,安全性较差。该文介绍了虾青素的结构性质、虾青素来源和生产方法,着重讲述红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）生产虾青素的生物合成途径、发酵培养条件以及虾青素的破壁提取和纯化方法,为虾青素工业化生产提供一定理论基础。     

胁迫条件下褪黑素诱导雨生红球藻虾青素合成

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在胁迫条件下可大量积累虾青素,已成为天然虾青素的主要来源。通过解析外源褪黑素(Melatonin,MLT)调控雨生红球藻在缺氮联合高光照胁迫条件下的防御效应,以期建立虾青素高效合成的技术体系。结果表明,胁迫条件下外源MLT的诱导显著促进了虾青素的积累,最高质量分数达到32.37 mg/g,较对照组增加了2.25倍。此外,外源MLT提高了胞内NO和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的含量,同时上调了虾青素合成关键酶基因dxs和chy的表达水平。研究表明,外源MLT诱导高光缺氮胁迫下雨生红球藻中虾青素的高效合成可能与MLT调控藻细胞内的NO、MAPK含量和虾青素合成关键酶基因dxs和chy的表达水平相关。     

雨生红球藻中虾青素的研究进展

虾青素是一种具有众多生理功能的类胡萝卜素,经济价值极高,但是在自然界中含量较少,其最佳生物来源-雨生红球藻中含量也不超过5%,且该藻的细胞壁较厚,虾青素提取不充分,造成部分虾青素浪费。因此,如何充分提取雨生红球藻中的虾青素已成为研究热点。就虾青素的生理功能、提取方法、雨生红球藻的破壁方法展开论述。