骨髓间充质干细胞在脊髓损伤模型大鼠体内的转化

目的观察静脉移植骨髓间充质干细胞(MSCs)在脊髓损伤模型大鼠体内向神经样细胞转化的情况。方法体外扩增培养MSCs,流式细胞仪检测表面标志CD34和CD44的表达;采用击打法制备大鼠脊髓损伤模型;Brdu标记的MSCs经尾静脉移植入脊髓损伤模型大鼠体内,输注后21d,取脊髓组织进行免疫组化染色,检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果体外扩增的MSCs经流式细胞仪检测不表达CD34,表达CD44;激光共聚焦显微镜下观察可见,移植Brdu标记的MSCs组在大鼠损伤的脊髓组织中可同时表达Brdu和NSE。结论移植的MSCs可迁移到损伤的脊髓组织,并可转化为神经样细胞。     

人T-bet和HBV-L共表达质粒的构建及体外表达

目的构建人转录因子T-bet基因与乙肝病毒表面抗原大蛋白全长基因(hepatitis B virus surface antigen large protein,HBV-L)的共表达载体,并检测其在体外的表达。方法利用PCR及基因重组技术,以人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的cDNA为模板,扩增获得人T-bet全长基因,以含有HBV-L的质粒pcDNA3.1-HBV-L为模板,扩增获得HBV-L基因,将上述2个基因克隆至真核表达质粒p IRES中,获得共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L。将该质粒转染293T细胞,经RT-PCR、ELISA和细胞免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。结果限制性酶谱分析及测序证实重组质粒p IRES-T-bet-HBV-L构建成功;该质粒在体外转染293T细胞后,可表达T-bet与HBV-L两者的mRNA;细胞免疫荧光试验和ELISA检测结果证实,该质粒转染293T细胞后可表达T-bet和HBV-L蛋白。结论成功构建了共表达质粒pIRES-T-bet-HBV-L,该质粒能在293T细胞中表达。     

矮化蓖麻RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

目的优化矮化蓖麻RAPD-PCR反应体系及扩增程序。方法采用正交试验设计,优化RAPD-PCR反应体系(引物、dNTP、Taq酶和Mg2+浓度)及扩增程序(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间和循环次数)。结果25μl反应体系中最佳浓度配比为:引物0.36μmol/L,dNTP0.24mmol/L,Taq酶0.05U/μl,Mg2+1.20mmol/L;最佳扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性45s,36℃退火45s,72℃延伸80s,共35个循环;最后72℃再延伸5min。结论已优化了矮化蓖麻RAPD-PCR的反应体系及扩增程序,为应用RAPD-PCR技术对蓖麻株高性状进行研究奠定了基础。     

谷氨酰胺和丙酮酸钠对NK-92细胞体外扩增的影响

为了优化免疫细胞体外培养体系实现其高效扩增,以自然杀伤细胞系(natural killer-92 cells,NK-92)为对象,通过氨基酸代谢分析及正交实验设计优化了关键代谢物浓度,并在有/无血清培养基中进行了验证。结果表明,谷氨酰胺丙酮酸钠浓度对NK-92细胞的体外扩增有显著影响,其最适浓度为13.0和2.5 mmol·L~(-1)。在此浓度下,有血清培养体系中NK-92细胞扩增15 d后,其扩增倍数可达到(3 712.85±225.74)倍,显著高于优化前对照组的(2 255.93±243.00)倍(p0.05);其杀伤活性均值由57.23%提高到63.53%;无血清体系中NK-92细胞扩增15 d后,其扩增倍数可达到(3 193.59±199.99)倍,明显高于对照组的(1 917.16±242.87)倍(p0.05),且显著提高了扩增后NK-92细胞中CD3~-CD56~+细胞比例和杀伤活性(p0.05)。该结果可为免疫效应细胞无血清培养基的开发提供技术支持。     

日本天野酶公司争取全球酶市场前三名地位

日本天野酶公司(Amano Enzyme)是日本最大的酶生产企业。该公司前不久宣称,他要成为全球酶市场的三大供应商之一。为此目的,他计划加紧在美国和欧洲市场的产品销售活动,积极推进酶技术的应用开发。2002年天野酶公司与大和化成公司(Daiwa Kasei)合作,加强了酶的应用开发。大和化成公司在日本酶市场居第四位,食品酶是其强项。     

天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性

目的构建天蚕素A(1～8)-蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽(CA-MA杂合肽)突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测。方法采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG。将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化。分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测。结果重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性。结论已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA。     

感染性疾病RNA病毒性病原体生物信息学检测方法的建立

目的以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法。方法应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链cDNA,TaqⅠ酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因;PCR产物克隆后,酶切鉴定并测序,经GenBankBLAST软件进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增HIV患者血清中外源基因得到多个DNA片段;重组克隆质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,可见插入片段存在;将所有PCR产物测序,序列与已知病原基因序列一致。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测RNA病毒性病原体。     

黄原胶支持CIK细胞高密度扩增

基于细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)的细胞疗法是癌症治疗的关注热点之一,获得足够数量具有功能的效应细胞是临床应用的重要环节,而实现效应细胞高密度培养,减少培养体积,是降低治疗成本的有效途径。黄原胶作为一种信号分子,具有调控细胞增殖的活性。为此,以外周血单个核细胞为研究对象,以总细胞扩增倍数、效应细胞比例和扩增倍数,以及扩增后CIK细胞对K562细胞的杀伤活性为评价指标,考察了黄原胶对CIK细胞体外高密度扩增的影响。结果显示:当接种密度为4×106 cells×mL~(-1)时,在含有100μg×mL~(-1)黄原胶的无血清培养基中,总细胞扩增倍数可达到150.0±29.1,显著高于不含黄原胶对照组的41.1±5.1(p0.05);CD3+CD56+细胞的比例和扩增倍数分别为(16.7±7.6)%和321.4±48.6,显著高于对照组的(13.2±6.8)%和71.4±31.3(p0.05);而且添加黄原胶时扩增后CIK细胞对K562细胞杀伤活性的均值可从28.7%增加到34.3%。该研究结果可为CIK细胞体外扩增过程的优化提供技术支持。     

Benzonase酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗动物安全性评价

目的对Benzonase非限制性核酸内切酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗进行动物安全性评价。方法依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》,对经Benzonase酶处理的冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)进行豚鼠全身主动过敏性试验、体外溶血性试验、大鼠急性毒性试验和家兔肌肉刺激试验,评价疫苗的安全性。结果狂犬病疫苗豚鼠过敏反应发生率为50%,5 min后恢复正常;体外溶血结果为阴性;大鼠急性毒性试验未见异常;家兔肌肉刺激性试验在注射部位肌肉局部出现了极轻度到轻度的间质炎性细胞浸润、肌肉组织变性坏死及间质纤维组织增生,给药后2周,上述病变程度明显缓解。结论利用Benzonase非限制性核酸内切酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗(酶残留量低于0.2 ng/ml)安全性良好,不影响其临床使用。     

Tgo DNA聚合酶的表达、纯化及其扩增性能

目的表达、纯化Tgo DNA聚合酶,并检测其扩增性能。方法采用PCR技术从嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius中扩增Tgo DNA聚合酶基因,并克隆至含His-Tag靶序列的pET101载体中,转化E.coliBL21Sta(rDE3),IPTG诱导表达。目的蛋白纯化后经SDS-PAGE分析,并利用标准pfu酶,采用对比法初略测定酶活性;以质粒pUC19为模板,用Tgo酶和pfu酶进行PCR扩增,比较二者的扩增效率,采用改进的蓝白试验法检测Tgo酶的扩增忠实性。结果 PCR扩增的Tgo DNA聚合酶基因大小约2300bp,根据测序获得的基因序列推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的序列一致。表达的目的蛋白为可溶性蛋白,相对分子质量约为89000,表达量为350μg/gE.coli,50%甘油保存的酶活性约为5U/μl。Tgo酶和pfu酶的扩增产出率和忠实性均相当。结论成功表达并纯化了Tgo DNA聚合酶,其扩增性能与pfu酶相当。     

山茶籽油对D-半乳糖亚急性小鼠皮肤的影响

测定和对比了山茶籽原油和山茶花润肤油的脂肪酸组成、体外抗氧化能力以及对衰老小鼠皮肤的影响。采用气相色谱与质谱联用技术对山茶籽原油与山茶花润肤油的脂肪酸成分进行了分析与对比;获取山茶籽原油与山茶花润肤油的乙醇提取物,采用DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)法和ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)法测定二者的体外抗氧化活性;采用1g/(kg·d)的D-半乳糖溶液背部皮下注射建立小鼠衰老模型,皮肤涂抹山茶油进行体外干预,观察小鼠皮肤组织的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)的改变以及小鼠皮肤的形态学变化。结果表明,二者不饱和脂肪酸含量丰富,主要有油酸和亚油酸。在体外抗氧化实验中,二者对化学体系产生的自由基都具有较强的清除作用,并与其质量浓度呈一定的正相关关系。在体内实验中,相较于正常组,模型组小鼠皮肤的SOD、CAT、GSH-Px、Hyp含量降低,MDA含量升高,小鼠表皮和真皮厚度降低,胶原纤维含量下降。体外干预后,小鼠皮肤的SOD、CAT、GSH-Px、Hyp含量升高,MDA含量下降,表皮和真皮厚度升高,胶原纤维含量丰富。对山茶油进行体内、体外相结合的抗氧化实验研究得出山茶油具有一定的延缓皮肤衰老的作用。     

磁性搅拌珠制备及在NK-92细胞体外扩增中的应用

悬浮细胞的生长对剪切力较敏感,在搅拌式生物反应器中采用球体搅拌可减少流体剪切力对细胞扩增的影响。为此,研究采用两步法制备海藻酸钠/壳聚糖双组分磁性搅拌珠并将其运用于磁力搅拌瓶,用于NK-92细胞的动态培养。结果显示,当海藻酸钠质量浓度达到25 mg×m L~(-1)时,磁性搅拌珠的力学性能最佳;用于NK-92细胞扩增时,在保证细胞活性的同时,总细胞扩增倍数以及扩增后的细胞杀伤活性分别可达到(72.63±7.80)倍和(85.57±3.69)%,显著高于T 25培养瓶静态培养时的(22.41±1.46)倍(p(27)0.05)和(70.53±1.72)%(p(27)0.05)。研究结果为悬浮细胞动态培养设备的设计提供了新的思路,为免疫细胞的体外扩增提供了技术支持。     

白腐菌木素过氧化物酶发酵条件及其酶液对稻草降解的研究

研究营养条件对白腐菌合成木素过氧化物酶(ligninperoxidase,LiP)的影响。在最适培养条件下,第6天获得7560U/L的酶活。利用LiP粗酶液在体外直接降解稻草,3天后Klason木素的降解率为8.7%,经红外光谱分析其降解产物,推断LiP粗酶液在体外降解稻草的反应主要是氧化反应。     

低氧条件下微囊化成骨细胞调控造血干/祖细胞扩增的研究

成骨细胞是造血干/祖细胞生态位区的重要组成部分,而较低的氧分压则是这一区域的另一特点.本研究在体外模拟造血生态位区,考察成骨细胞在低氧环境中对造血干/祖细胞特性维持和数量扩增的调控作用.采用聚电解质络合法将成骨细胞包埋,随后与人脐带血单个核细胞(CB-MNCs)分别在低氧(5% 氧分压)和常氧(20% 氧分压)培养箱中共培养,设置非共培养组作对照,培养7 d.每天取样计细胞数,检测体系葡萄糖、乳酸浓度,并做CFU-Cs集落和CD34+ 含量检测.结果表明:经过7 d的培养,低氧下与载成骨细胞GAC微珠共培养的CB-MNCs扩增了18.7±1.6倍;CD34+ 细胞含量由培养前的2.0%上升到2.5%,细胞数扩增了23.4±2.0倍;CFU-Cs产率为培养前的11.6±0.9倍.扩增效果显著优于常氧共培养和非共培养体系.析因方差分析结果表明,成骨细胞对造血干/祖细胞扩增有非常显著的作用,而低氧条件只在成骨细胞存在时才有明显促进作用.本实验结果为进一步了解成骨细胞对造血干/祖细胞生长调节的作用机制以及造血干/祖细胞的体外大规模扩增培养提供了新思路.     

重组腺病毒载体pAd-4-hMASP-2的构建

目的 利用p Yr-adshuttle-4质粒构建重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2。方法 应用PCR技术扩增甘露糖凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(human mannan-binding lectin associated serine protease-2,h MASP-2)基因,经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后与p Yr-adshuttle-4质粒连接,构建穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2,在LR酶作用下与腺病毒骨架载体p Ad/PL-DEST进行体外同源重组,获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒r Adh MASP-2,应用酶切、PCR扩增及基因测序进行鉴定,并测定病毒滴度。将r Ad-h MASP-2感染小鼠,实时荧光定量PCR法检测h MASP-2基因m RNA在小鼠肺组织中的表达。结果 重组穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2经双酶切及测序证实构建正确,通过同源重组获得了重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,扩增出滴度为1.5×109 PFU/ml的重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,其能在小鼠肺组织中表达。结论 成功获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2和重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,为体内外研究h MASP-2的活性提供了有效的转基因载体。     

肠道病毒71型多克隆抗体F(ab’)2片段的制备及其体外中和效果评价

目的制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)多克隆抗体F(ab’)2片段,并评价其体外中和效果。方法采用硫酸铵分级沉淀法从EV71感染的兔血清中提取Ig G,用胃蛋白酶进行酶解,正交试验确定最佳酶解条件;使用阴离子交换层析(Q Sepharose Fast Flow)纯化得到F(ab’)2片段,采用体外中和试验检测其对EV71的中和效果。结果硫酸铵分级沉淀法得到电泳纯的Ig G;最佳酶解条件为:胃蛋白酶与Ig G按1∶10的质量比混合,47℃反应4 h,在此条件下,F(ab’)2的产率最大值为79.51%,且方差分析表明,酶切比例对F(ab’)2产率的影响最大,温度次之,时间对F(ab’)2产率的影响不明显;经阴离子交换层析纯化,可有效去除Fc片段,得到电泳纯的F(ab’)2;F(ab’)2具有与Ig G、正常血清同等的中和效果。结论成功制备了EV71兔多克隆抗体F(ab’)2片段,初步确定该F(ab’)2片段具有良好的体外中和效果。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力

目的探讨人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力。方法收集健康足月产胎儿脐带组织,采用酶消化法从华通氏胶中分离hUCMSCs,选取第3代对数生长期细胞,显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞免疫表型分子的表达,免疫荧光染色检测干细胞标记物及其体外向肌源性细胞的分化,荧光显微镜观察及流式细胞术检测携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染hUCMSCs后GFP的表达。结果采用酶消化法获得可贴壁生长的大量hUCMSCs,其能在体外成功进行扩增培养。hUCMSCs可高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而极低表达CD14、CD34、CD45和HLA-Ⅱ;能表达干细胞标记物Oct4和Sox2,且在体外特殊培养条件下表达骨骼肌干细胞标记物Pax7和Myo D;转染的hUCMSCs可稳定表达GFP,转染率高达50%~70%。结论人脐带华通氏胶组织存在间充质干细胞,且其具有向肌源性细胞分化的潜能。     

气升式环流中空纤维膜生物反应器内骨髓间充质干细胞的培养与扩增

骨髓间充质干细胞(MSCs)具有多向分化的潜能,是重要的组织工程"种子细胞"和理想的基因治疗靶细胞,但在骨髓中的含量非常少,需体外扩增才能满足临床需求.今将第四代MSCs与Ⅰ型胶原溶液混合后接种于中空纤维膜(HFMs)内,置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内1 h后形成凝胶,然后将此HFMs接种至气升式环流生物反应器(ALB)内,进行MSCs的三维动态培养与扩增.实验过程中每24 h取样测吸光度、计细胞数、绘制细胞生长曲线,测定细胞代谢参数,并对扩增的细胞进行流式细胞仪分析及多向诱导分化检测.结果表明:在气升式环流中空纤维膜生物反应器(ALHFMB)内,O2含量基本保持恒定;细胞代谢旺盛,MSCs扩增倍数明显增加,7 d后扩增近16倍;扩增的细胞仍保持MSCs表型并具有较强的成骨、成软骨及成脂肪的多向分化能力.     

土鳖虫不同酶解提取物的体外抑菌活性研究

采用不同酶酶解土鳖虫粉,用Folin酚比色法测定不同酶解提取物的质量得率和肽含量;然后以金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌和大肠埃希氏杆菌为受试菌株,通过体外抑菌实验测定酶解提取物的抑菌活性。结果表明,土鳖虫胃蛋白酶酶解提取物的肽含量最高,达到36.5%;胃蛋白酶酶解提取物对3种受试菌株均有不同程度的抑制作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为12.5mg·mL~(-1)和25.0mg·mL~(-1)。