基于中心组合设计和响应面分析的血清替代物浓度优化

细胞因子诱导杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells,CIK cells)是一类广泛应用的肿瘤过继免疫疗法的效应细胞,其体外扩增过程中常需要使用无血清培养基。今以胰岛素、亚麻酸、胆固醇和乙醇胺4种可替代血清促进细胞扩增的组份为研究对象,采用中心组合设计和响应面分析相结合的方法,考察上述组分的浓度以及相互作用对单个核细胞扩增的影响,得到了可支持单个核细胞扩增的最优浓度,分别为10、5.66、19.86和1.22 mg?L?1。将上述4种组分以优化的浓度添加到DMEM/F12和IMDM以1:1体积比混合而成的基础培养基中,制成无血清培养基Optimizer。以含10%FBS的RPMI 1640为对照,采用半量稀释法培养脐血单个核细胞,以培养14天的总细胞扩增倍数、细胞组成、CD3+CD56+细胞扩增倍数以及对K562细胞的杀伤活性为指标,评价了制成的无血清培养基Optimizer支持CIK细胞扩增的效果。结果显示,采用所制备的无血清培养基Optimizer,总细胞扩增倍数为56.54±18.87,明显高于SFM1的5.14±1.03(p0.05)和SFM2的3.59±0.56(p0.05),与含10%FBS的RPMI 1640的35.24±20.92(p0.05)接近;CD3+细胞为97.98%±1.41%,与含10%FBS的RPM I1640的94.34%±1.29%相当(p0.05);尽管CD3+CD56+细胞比例18.17%±7.38%低于含10%FBS的RPMI 1640中的数值25.49%±3.35%(p0.05),但两种培养基的CD3+CD56+细胞扩增倍数分别为440.86±222.89和429.27±249.16,没有显著性差异(p0.05);当效靶分别为9:1时分别采用两种培养基扩增的细胞对K562细胞的杀伤活性均能达到50%以上。该研究结果为用于CIK细胞体外扩增的无血清培养基的开发提供了依据。     

谷氨酰胺和丙酮酸钠对NK-92细胞体外扩增的影响

为了优化免疫细胞体外培养体系实现其高效扩增,以自然杀伤细胞系(natural killer-92 cells,NK-92)为对象,通过氨基酸代谢分析及正交实验设计优化了关键代谢物浓度,并在有/无血清培养基中进行了验证。结果表明,谷氨酰胺丙酮酸钠浓度对NK-92细胞的体外扩增有显著影响,其最适浓度为13.0和2.5 mmol·L~(-1)。在此浓度下,有血清培养体系中NK-92细胞扩增15 d后,其扩增倍数可达到(3 712.85±225.74)倍,显著高于优化前对照组的(2 255.93±243.00)倍(p0.05);其杀伤活性均值由57.23%提高到63.53%;无血清体系中NK-92细胞扩增15 d后,其扩增倍数可达到(3 193.59±199.99)倍,明显高于对照组的(1 917.16±242.87)倍(p0.05),且显著提高了扩增后NK-92细胞中CD3~-CD56~+细胞比例和杀伤活性(p0.05)。该结果可为免疫效应细胞无血清培养基的开发提供技术支持。     

白血病K562细胞株中CD34~+细胞群的分离及其生物学特性

目的分离白血病K562细胞株中CD34+细胞群,并分析其生物学特征,为从干细胞角度治疗白血病提供实验依据。方法采用免疫磁性分选法分离K562细胞中CD34+细胞群,台盼蓝拒染法检测细胞活性;流式细胞术检测CD34+细胞比例及细胞周期;单细胞克隆培养检测CD34+细胞自我更新能力;RT-PCR法检测CD34+细胞分化相关指标促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)基因mRNA的转录水平;并检测CD34+细胞耐药蛋白P-gp(P-glycoprotein)的表达。结果免疫磁性分选法可有效分离出CD34+细胞群,细胞活性为99%～100%;分离的CD34+细胞含量占细胞总数的78.5%～85.3%,细胞大部分处于静止状态,G0/G1期细胞比例达80%左右,显著高于分离前的K562细胞;CD34+细胞群具有形成混合集落的能力;与K562细胞相比,CD34+细胞EPO和GM-CSF基因mRNA的转录水平明显下降(P<0.01),P-gp表达阳性。结论成功从K562细胞株中分离了CD34+细胞群,其具有自我更新和多向分化的能力,表明其具有白血病干/祖细胞的生物学特点。     

磁性搅拌珠制备及在NK-92细胞体外扩增中的应用

悬浮细胞的生长对剪切力较敏感,在搅拌式生物反应器中采用球体搅拌可减少流体剪切力对细胞扩增的影响。为此,研究采用两步法制备海藻酸钠/壳聚糖双组分磁性搅拌珠并将其运用于磁力搅拌瓶,用于NK-92细胞的动态培养。结果显示,当海藻酸钠质量浓度达到25 mg×m L~(-1)时,磁性搅拌珠的力学性能最佳;用于NK-92细胞扩增时,在保证细胞活性的同时,总细胞扩增倍数以及扩增后的细胞杀伤活性分别可达到(72.63±7.80)倍和(85.57±3.69)%,显著高于T 25培养瓶静态培养时的(22.41±1.46)倍(p(27)0.05)和(70.53±1.72)%(p(27)0.05)。研究结果为悬浮细胞动态培养设备的设计提供了新的思路,为免疫细胞的体外扩增提供了技术支持。     

两种培养袋对细胞因子诱导的杀伤细胞分化增殖作用的比较

目的比较两种不同品牌培养袋对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)分化增殖效果的影响,为CIK细胞扩增培养方法提供依据。方法采集10例肿瘤患者静脉血,分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用CIK培养方案进行诱导培养,分别使用A、B两种培养袋扩增同一来源细胞。培养14 d后检测细胞终浓度、细胞活率,流式细胞术分析细胞表型。结果同一患者细胞使用A、B两种培养袋扩增14 d,B组总细胞数和活细胞数均显著高于A组(P均0.01);两组CD3+CD56+表型细胞比率差异无统计学意义(P0.05);B组CD3+CD8+CD56+表型细胞比率显著大于A组(P0.05)。结论 B培养袋培养细胞的增殖倍数大于A培养袋,B培养袋较A培养袋有更好的CIK细胞扩增效果。     

改良RPMI1640培养基对CIK细胞增殖的影响

目的探讨改良RPMI1640培养基对CIK细胞体外增殖的影响,为临床治疗提供质量好、数量多的CIK细胞。方法用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞,分别采用传统RPMI1640培养基和改良RPMI1640培养基培养,于培养当天及3、6、9、12、15、18d,采用台盼蓝拒染法计数细胞,检测细胞的增殖水平;流式细胞术分析细胞表型;MTT法检测CIK细胞的体外细胞毒活性。结果培养至第12天后,改良培养基培养条件下,CIK细胞的增殖倍数明显高于传统培养基培养的CIK细胞(P<0.05);CD3+CD56+细胞比例达33%以上;培养15d,对BGC-823和SPC-A-1细胞的细胞毒活性均高于传统培养基。结论改良RP-MI1640培养基较传统RPMI1640培养基可更好地促进CIK细胞增殖,为其临床应用提供了试验数据。     

人胎盘来源的造血干细胞和间充质干细胞的分离及鉴定

目的建立人胎盘来源的造血干细胞(placenta hematopoietic stem cells,hP-HSCs)和间充质干细胞(placentaderived mesenchymal stem cells,hP-MSCs)的分离方法,并进行鉴定和组分分析。方法选取10份新生健康婴儿胎盘组织,采用机械破碎法联合磁珠分选法分离h P-HSCs,胎盘绒毛膜组织块贴壁法分离hP-MSCs,利用形态学观察、集落培养、流式细胞术等进行鉴定。结果 hP-HSCs:分离后有核细胞数(total nucleated cell number,TNC)为(11. 82±2. 46)×10~8个,TNC回收率≥80%;细胞活性为(99. 7±0. 3)%;细胞表面抗体CD34~+CD45dim表达率为(8. 69±0. 36)%,CD34~+总数为(108. 0±6. 48)×10~6个;集落形成总数为(1. 88±1. 07)×10~6。hP-MSCs:冻存细胞总数为(40. 78±9. 35)×10~7个;细胞活性为(99. 0±1. 5)%;细胞表面抗体CD34~+CD45~+表达率为(0. 1±0. 1)%,CD44~+CD105~+为(99. 6±0. 2)%,CD14~+CD19~+为(0. 1±0. 1)%,CD90~+CD73+为(98. 9±0. 2)%;且具有良好成脂、成骨分化潜能。结论成功建立了hP-HSCs和hP-MSCs体外分离培养方法,为胎盘的临床应用奠定了基础,并提供了细胞种子资源。     

细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗的研究进展

过继免疫细胞治疗作为一种新的方法已用于常规治疗无效的实体肿瘤,在肿瘤的治疗中有着巨大的应用潜力。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)是人外周血单个核细胞经多种细胞因子体外扩增所得的一群异质细胞。CIK兼有T淋巴细胞的强大抗瘤活性和自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)非主要组织相容性复合体(major histochompatibility complex,MHC)限制杀瘤特点,对多种实体肿瘤有较好的疗效。本文就CIK细胞的生物学特点、杀瘤机制及其临床疗效的最新进展进行综述。     

1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8~+T细胞对病理性CD4~+T细胞的抑制作用

目的观察1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8+T细胞对病理性CD4+T细胞的抑制作用。方法用1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠,并同时设立噬菌体空载体免疫组和未免疫空白对照组。于初次免疫后第20周,检测各组小鼠血糖;磁珠法分离免疫小鼠CD8+T细胞,并用合成反义肽及IL-2诱导刺激作为效应细胞;分离噬菌体空载体免疫组和空白对照组小鼠CD4+T细胞,用合成正义肽及IL-2诱导刺激作为靶细胞。将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL的杀伤活性。结果初次免疫后第20周,1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组小鼠血糖水平保持正常,而另外2组小鼠血糖均高于正常水平。1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组诱导的CD8+T细胞作效应细胞,当效靶比为100∶1时,对噬菌体空载体免疫组CD4+T细胞的杀伤效率最高,达47.95%±11.30%,而噬菌体空载体免疫组诱导的小鼠CD8+T细胞对空白对照组的CD4+T细胞无杀伤作用。结论1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗能够诱导CD8+T细胞抑制病理性CD4+T细胞。     

Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建pre-miR-10a(miR-10a前体)重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV pre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100 MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。     

特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应

目的检测特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对恶性肿瘤细胞的杀伤效应。方法采用肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞共培养,分析其免疫表型,并用MTT染色法检测其对肿瘤细胞的杀伤力。结果所获得DC-CIK细胞的CD3异质性T细胞群,对肾透明细胞癌786-0和前列腺癌PC-3细胞的杀伤率分别为70.64%和65.65%。结论DC-CIK细胞对肾透明细胞癌786-0细胞和前列腺癌PC-3细胞具有较强的杀伤效应。     

异鼠李素抗癌活性研究

为了研究沙棘中异鼠李素的抗癌活性,分别采用了SRB法测试不同浓度异鼠李素对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的抑制率以及MTT法测试不同浓度异鼠李素对人白血病细胞株K562和HL60的抑制率。结果为不同浓度异鼠李素对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的抑制率达(59.42±4.40)%~(69.55±3.17)%,其中0.063μmol/mL异鼠李素对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞抑制率为(69.55±3.17)%,与0.3μmol/mL阿霉素相当;不同浓度异鼠李素对人白血病细胞株K562的抑制率达(9.84±1.14)%~(100±4.12)%,其中0.633μmol/mL异鼠李素对人白血病细胞株K562细胞抑制率为(100±4.12)%,与10μmol/mL阿霉素相当;不同浓度异鼠李素对人白血病细胞株HL60的抑制率达(12.50±1.41)%~(100±6.89)%,其中0.633μmol/mL异鼠李素对人白血病细胞株HL60细胞抑制率为(100±6.89)%,与10μmol/mL阿霉素相当。可见异鼠李素具有一定的抗癌活性。     

抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对人自然杀伤细胞肿瘤杀伤活性的抑制作用

目的探讨抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对体外扩增的人自然杀伤(Natural killer,NK)细胞的肿瘤杀伤活性的影响。方法体外活化人外周血单个核细胞来源的NK细胞,并检测其表面黏附分子DNAM-1和LFA-1的表达水平;通过Trans-well阻隔试验,阻断NK细胞与靶细胞接触,考察细胞-细胞直接接触对NK细胞杀伤活性的影响;通过NK细胞毒性试验,引入抗DNAM-1单克隆抗体和抗LFA-1单克隆抗体,阻断相应信号途径,考察相关黏附分子在NK细胞肿瘤杀伤过程中的作用。结果体外活化的NK细胞高表达表面黏附分子DNAM-1和LFA-1。阻断NK细胞与靶细胞接触,NK细胞的肿瘤杀伤效应大大降低。应用单克隆抗体阻断DNAM-1或LFA-1信号途径,可显著降低NK细胞肿瘤的杀伤效应;联合阻断DNAM-1和LFA-1信号途径,可进一步降低NK的细胞杀伤效应。结论细胞-细胞间直接接触是NK细胞发挥肿瘤杀伤效应的重要机制,表面黏附分子DNAM-1和LFA-1介导的信号途径对维持NK细胞肿瘤杀伤活性具有重要意义。     

Musashi2对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响

目的探讨Musashi2(Msi2)对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响。方法将靶向Msi2基因的si-RNA1、siRNA2及阴性对照序列转染K562细胞,同时设空白对照组(未转染的K562细胞)。实时荧光定量PCR法及Western blot法分别检测K562细胞中Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平;经细胞生长曲线观察细胞体外增殖能力;细胞黏附试验检测K562细胞体外黏附能力;Transwell试验检测K562细胞体外迁移及侵袭能力。结果与阴性对照组及空白对照组比较,Msi2-1及Msi2-2组K562细胞中的Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),体外黏附、迁移、侵袭能力明显减弱(P<0.05)。结论抑制Msi2的表达可显著抑制白血病K562细胞的体外侵袭能力,本实验为进一步研究Msi2在白血病发生发展中的调控机制奠定了基础。     

BCG-CpG-DNA免疫活性作用的初步研究

目的研究BCG-CpG-DNA的免疫学活性。方法通过淋巴细胞增殖、T细胞亚群分析、细胞因子产生、对NK细胞杀伤功能影响等试验,检测BCG-CpG-DNA的免疫活性。结果BCG-CpG-DNA能促进小鼠T、B淋巴细胞增殖,活化巨噬细胞分泌IL-12,并能增强ConA诱导IFN-γ产生,提高小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的含量,同时增强小鼠NK细胞的杀伤活性。实验组与对照组所有结果差异均有显著意义(P<0.05)。结论BCG-CpG-DNA能活化抗原呈递细胞(APC),并具有较好的免疫活性。     

重组耻垢分枝杆菌NY-ESO-1疫苗的制备及其免疫原性分析

目的制备重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.smegmatis)NY-ESO-1疫苗,并分析其在小鼠体内的免疫原性。方法从人睾丸m RNA中扩增NY-ESO-1基因,克隆至携带β半乳糖苷酶信号肽的表达载体,转化M.smegmatis,构建r M.smegmatis。以rM.smegmatis经腹腔免疫小鼠,200μl/只,于第12周用NY-ESO-1加强免疫1次,第3、6、9、12、13周经尾静脉采血1次,分离血清,并于第13周取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,检测小鼠血清中NY-ESO-1抗体及其亚型、CD4~+、CD8~+T细胞比例、脾细胞增殖能力、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力。结果加强免疫后,与NY-ESO-1组比较,rM.smegmatis-p LA71NY组小鼠血清抗体水平差异无统计学意义(P0.05),CD4~~+及CD8~+T细胞比例、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力均显著升高(P0.05),脾细胞的增殖能力显著下降(P0.05)。结论 rM.smegmatis NY-ESO-1疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性,为该疫苗用于肿瘤的免疫治疗奠定了基础。     

同时扩增与收获脐带血来源造血干细胞及间充质干细胞的研究

目的为利用生物反应器,实现脐带血(Umbilical cord blood,UCB)来源的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)与间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的同时扩增与收获。方法为在不添加血清、只添加细胞因子组合(SCF15ng·mL-1,FL5ng·mL-1,TPO6ng·mL-1,IL-315ng·mL-1,G-CSF1ng·mL-1,GM-CSF5ng·mL-1)及海藻酸钙壳聚糖胶珠包被基质细胞支持的条件下,采用玻璃包被的聚苯乙烯(Glass coated styrene copolymer,GCSC)微载体与生物反应器相结合的策略,考察了UCB-HSCs与UCB-MSCs在转瓶及旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor,RWVB)内的共培养。结果RWVB中的扩增效果最佳,12天内有核细胞(Nuclear cells,NCs)扩增了3.7±0.3倍;集落形成细胞(Colony-forming units in culture,CFU-Cs)扩增了5.1±1.2倍;CD34+CD45+CD105-(HSCs)细胞扩增了5.2±0.4倍;CD34-CD45-CD105+(MSCs)细胞扩增了13.9±1.2倍。培养结束后,通过自由沉降的方法分离UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体表面的UCB-MSCs。同时,细胞多向诱导分化及免疫表型分析结果显示,粘附在GCSC微载体表面上的细胞能够向骨、软骨及脂肪细胞分化;并能够表达间质细胞相关表面标志CD13,CD44,CD73和CD105,而不表达造血细胞的相关表面标志CD34,CD45及HLA-DR,与骨髓MSCs相一致。结论为添加细胞因子、基质细胞及微载体支持的条件下,在生物反应器内能够实现UCB-HSCs和UCB-MSCs的同时扩增与收获。     

低温冷冻对CIK细胞诱导及活性影响的研究

目的 研究低温冷冻对CIK(cytokine-induced killer cells)细胞诱导及活性的影响,方法 用经过程序降温仪冷冻后的脐血单个核细胞定向诱导CIK细胞,其活性与用新鲜的脐血单个核细胞定向诱导生成的CIK细胞进行比较,并对冷冻过的经21d诱导生成的CIK细胞,与未冻存过的细胞进行活性比较。用乳酸脱氢酶(LDH)分析法分析细胞毒活性,用流式细胞分析仪分析CIK细胞的纯度。结果 冻存后的脐血单个核细胞诱导生成的CIK细胞在扩增能力、纯度和细胞毒性方面与新鲜细胞诱导生成的CIK细胞无明显差异;经过冻存的CIK细胞在纯度和细胞毒性方面与未冻存前也无明显差异。结论 对于CIK细胞的临床应用具有指导意义。     

瓜馥木抗肿瘤活性研究

目的研究瓜馥木和黄酮化合物抗肿瘤活性。方法以半数抑制浓度(IC50)为评价抗肿瘤活性强度的指标,采用MTT法测定瓜馥木提取物和黄酮化合物体外抗肿瘤活性。结果 5,6,7,8-四甲氧基黄酮、石油醚、氯仿和乙酸乙酯的提取物均能显著抑制SPCA-1肺腺癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、BEL-7402肝癌细胞和K562白血病细胞增殖;水提取物只对K562白血病细胞有抑制作用。结论瓜馥木具有抗肿瘤活性。     

2-溴-4’-羟基查尔酮-苯磺酸酯衍生物的合成及抗肿瘤活性

基于药效团拼合原理设计并合成23个未见文献报道的 (E)-4-[3-(2-溴苯基)丙烯酰基]苯基-取代苯磺酸酯衍生物（产率：60.9-80.3%）,通过1HNMR、MS、13CNMR确证了产物结构,采用MTT法以5-氟尿嘧啶和伊马替尼为阳性对照药,以人宫颈癌Hela细胞、人肺癌A549细胞和人慢性粒细胞白血病K562细胞为测试细胞株评价了目标化合物的体外抗肿瘤活性。目标化合物Ⅴp表现出最强的A549细胞增殖抑制活性(半抑制浓度IC50 = 7.53 μmol/L),优于阳性对照药5-氟尿嘧啶(IC50 = 8.1 μmol/L),目标化合物Ⅴt表现出最强的K562细胞增殖抑制活性(IC50 = 4.47 μmol/L),目标化合物Ⅴd表现出最强的Hela细胞增殖抑制活性（IC50 = 4.53 μmol/L）,比阳性对照药5-氟尿嘧啶(IC50 = 13.5 μmol/L)强约3倍。目标化合物Ⅴd对A549细胞（IC50 = 8.0 μmol/L）和K562细胞（IC50 = 7.81 μmol/L）也表现出强的增殖抑制活性,值得进一步深入研究。