地杆菌α-L-岩藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用

对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造，以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库，筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶（mPbFuc29A1）。酶学性质研究结果表明mPbFuc29A1的最适pH值和温度分别为pH 5.0和40 ℃，最适温度较野生型PbFuc29A1提高了5 ℃；突变酶水解2’-FL的比活力提高到3 倍，但是水解4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP-FUC）和3’-岩藻糖基乳糖（3’-fucosyllactose，3’-FL）的比活力分别降低了22.8%和52.5%。以pNP-FUC和乳糖为底物，采用mPbFuc29A1酶法催化合成2’-FL和3’-FL，转化率分别为23.6%和56.4%，其中2’-FL的转化率较PbFuc29A1提高了9.1%。通过序列及定点突变分析发现mPbFuc29A1的氨基酸序列中有2 个位点发生突变（Asp21Val和Glu266Lys），其中位于loop区的Glu266Lys可能是mPbFuc29A1底物特异性和转糖苷产物组成发生改变的关键。优良的酶学特性使mPbFuc29A1在2’-FL合成中具有较大的应用潜力。     

基于HPLC-MS/MS的羊乳寡糖GP衍生化条件优化

高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS/MS）广泛应用于寡糖分析，但寡糖的复杂结构使寡糖的数据分析准确性存在诸多变数，衍生化效果的好坏对检测灵敏度与准确性至关重要。通过衍生化可以改变寡糖的疏水性或电荷性质，为提高质谱分析中多糖的电离效率和分析灵敏度提供了一种可行的方法。采用吉拉德试剂P(Girard’s Reagent P,GP)对母乳和羊乳寡糖的衍生化效率进行研究，结果表明随着GP溶液质量浓度和体积的增加，寡糖原型显著减少，50 mg 2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）中加入0.1 mol/L GP溶液5 mL时，GP衍生化效率达到99%以上，羊乳寡糖衍生化后6种寡糖检测结果与2’-FL平行一致，表明该种衍生化方法效果良好，此法可为乳寡糖的精准检测分析提供技术参考。     

2’-岩藻糖基乳糖的功能、合成及应用研究进展

2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)在母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中含量最高,研究证明2’-FL具备调节婴儿肠道菌群平衡、抵抗病原体的黏附、免疫调节和促进婴儿大脑神经发育等功能。合成2’-FL的方法有化学合成法、酶法合成法与全细胞合成法。2’-FL已经进入商业化生产阶段,其产业化受到产量、成本、品质及安全等因素的制约,需要在合成宿主、碳源的选择等方面进一步开展相关研究。2’-FL已被美国和欧洲联盟等国家批准可添加至婴幼儿配方食品及膳食补充剂中,研究证明添加了2’-FL的婴幼儿配方奶粉在营养成分和功效上更贴近母乳。本文综述了2’-FL的结构、母乳中的含量及其生理功能,总结了现阶段2’-FL的制备方法和应用情况,展望了2’-FL未来的研究方向,为2’-FL在婴幼儿配方食品中的开发及应用提供理论支持。     

不同通路配置对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的影响

在大肠杆菌BL21 Star (DE3)中建立了2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的从头合成途径，通过CRISPR/Cas9系统敲除了β-半乳糖糖苷酶基因lacZ M15序列和尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，探究了操纵子、假操纵子和单顺反子3 种不同通路配置对重组大肠杆菌合成2’-FL的影响。结果表明：从头合成途径的基因在大肠杆菌BL21 Star (DE3)过表达后摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度为0.34 g/L。敲除lacZ M15和wcaJ后，重组菌产生的2’-FL质量浓度增加到了1.26 g/L。在操纵子形式下，重组菌BS-7摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度最高，达1.92 g/L。BS-7在10 L发酵罐中分批补料发酵37 h后产生的2’-FL质量浓度达到14.04 g/L，2’-FL产率为0.59 g/（L·h），乳糖转化率为63%。因此，大肠杆菌合成2’-FL过程中，较低的基因表达强度更有助于提高其产量，同时可提高底物的转化效率。     

重组大肠杆菌补救途径合成2′-岩藻糖基乳糖的分子克隆和产物合成分析

2′-岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中含量最多的一种，对婴幼儿健康生长发育有重要作用，是极具应用价值的母乳概念配方奶粉添加剂。该研究通过比较不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶，选定幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT2与脆弱拟杆菌来源的L-岩藻糖激酶基因fkp共表达，构建了2′-FL的补救合成途径。对乳糖转运蛋白LacY以及2′-FL运出蛋白伯氏耶尔森氏菌来源的糖转运蛋白Tpyb或大肠杆菌来源的糖转运蛋白SetA适量过表达，大幅增加了胞外产物浓度。比较BL21(DE3)、C41(DE3)、JM109(DE3)这3种菌株的2′-FL合成能力，得到了基于JM109(DE3)的2′-FL最终合成菌株J2-V8。通过发酵条件优化，在摇瓶中48 h得到2′-FL的胞外质量浓度为2.67 g/L,较初始菌株提高了5倍，转化率为0.82 mol/mol岩藻糖，以上结果为2′-FL的生物制备技术开发提供了借鉴。     

2’-岩藻基乳糖对益生菌定殖及抗炎能力的影响

目的:探究2’-岩藻基乳糖（2’-Fucosyllactose,2’-FL）对乳酸菌和双歧杆菌增殖、粘附肠道细胞以及抗炎作用的影响。方法:以2’-FL和实验室的30株乳酸菌和双歧杆菌为研究对象,通过测定生物量、产酸和细胞粘附倍数的变化筛选出2’-FL可以增强定殖能力的菌株,再利用脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症模型进一步筛选出其中的潜在抗炎菌株,最后探究2’-FL和潜在抗炎菌株的联合抗炎效果。结果:30株实验菌株中,2’-FL仅能促进两歧双歧杆菌FL-276.1和FL-228.1的增殖,提高乳酸菌ML-1、FN515、FN518、FN249、ML329和双歧杆菌FL-276.1粘附Caco-2细胞的能力。其中两歧双歧杆菌FL-276.1、FL-228.1和鼠李糖乳杆菌FN518可以显著（P<0.05）降低脂多糖诱导的Raw264.7细胞炎症因子NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。2’-FL可以显著降低NO、IL-6和IL-1β的分泌。2’-FL与上述3株菌联用具有协同抗炎作用,但协同效果具有菌株差异性,其中FL-276.1与2’-FL协同抗炎效果最好。结论:2’-FL可以提高乳酸菌和双歧杆菌的定殖能力,并协同发挥抗炎功能,但效果具有菌株差异性,这一结果可以为预防早产儿坏死性小肠结肠炎提供新的选择。     

强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

利用全基因合成方法合成了强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的几丁质酶编码基因并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了可溶表达。利用该酶对低脱乙酰度壳聚糖进行水解并对获得的壳寡糖产物进行组成及结构分析。分子排阻高效液相色谱结果显示,水解产物相对分子质量分布范围为1?000～5?000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度2～9、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振对酶解产物壳寡糖的结构鉴定结果显示,所有寡糖组分的还原端均主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖组成。综上,本研究利用来源于强烈炽热球菌的几丁质酶制备了还原末端结构确定的低脱乙酰度壳寡糖,为复杂结构壳寡糖结构与功能关系研究提供了理论支持。     

枯草芽孢杆菌木聚糖酶的克隆表达及其酶解两种木聚糖的产物分析

通过基因克隆方法获得枯草芽孢杆菌木聚糖酶XynA,考察经镍离子亲和柱纯化后的XynA分别在桦木木聚糖和毛榉木木聚糖中的酶解情况,利用薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC）及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS）法鉴定木聚糖酶XynA的酶解产物。运用MALDI-TOF/MS分析枯草芽孢杆菌木聚糖酶XynA酶解桦木木聚糖和毛榉木木聚糖产物不同的聚合度寡糖的分布情况。结果表明：在桦木木聚糖酶解液中,产生的中性木寡糖主要为木二糖（X2）和木三糖（X3）,酸性木寡糖聚合度为4～12,并且每一个酸性木寡糖上仅连接着一个甲基葡萄糖醛酸侧链（MeG）。在毛榉木木聚糖酶解液中,产生的中性木寡糖与在桦木木聚糖酶解液中相同,酸性木寡糖的结构相似,聚合度为4～16。因此木聚糖酶XynA具有生产木二糖（X2）和木三糖（X3）以及酸性木寡糖（MeGXn）的功能。     

微生物合成共轭亚油酸机理的研究进展

相比于共轭亚油酸（CLA）的化学合成,微生物合成CLA与化学法具有培养灵活、对设备要求低、产物分离简单等优势。主要讨论了微生物合成CLA的研究进展,亚油酸（LA）能被微生物转化的原因,以及微生物合成CLA的机理。CLA的合成机理从微生物在动物瘤胃内混合发酵代谢LA和单一微生物在体外合成CLA两方面进行阐述。     

新型柑橘贮藏保鲜剂的研究进展

柑橘类果实在贮藏运输中果实表面易被腐败菌浸染而导致货架期和贮藏时间缩短,柑橘的贮藏保鲜方法一直以来都是业界关注的热点问题。本文介绍几种具有无毒、可生物降解、对环境无污染等特点的新型杀菌保鲜方法,其中包括动植物多糖涂膜保鲜（壳寡糖）、植物源提取物保鲜（精油）、生物保鲜剂（微生物代谢产物槐糖脂和拮抗菌）等处理方法。综合分析不同处理方法对柑橘类果实的贮藏效果及其对腐败菌的抑制作用,并对柑橘类果实采后防腐保鲜技术的发展趋势及其商业化前景进行展望。     

解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种重要的工业微生物菌种，被公认为食品级安全微生物。近年来，随着合成生物学和基因编辑技术的快速发展，科学家们利用合成生物学及基因编辑技术已经成功构建出了能够生产生物化学品、生物燃料、香料、药物、工业酶和药用蛋白等多种高附加值工业产品的解脂耶氏酵母细胞工厂，使得该酵母在食品、药品和生化能源等领域均具有巨大的应用潜力。本文将重点介绍解脂耶氏酵母表达系统、合成生物学元件和基因编辑方法的最新研究进展和应用情况，并对近年来以解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂生产高附加值产品的应用实例进行总结，希望为研究人员进一步利用解脂耶氏酵母进行底盘细胞设计、构建和优化相关合成途径并最终实现目的产物的高效合成提供有用的信息。     

香叶醇烷基改性壳寡糖的高效制备及表征

在之前研究的基础上,改进实验方案,提高香叶醇接枝壳寡糖衍生物的产率。通过香叶醇溴化和取代反应两步合成香叶醇烷基改性的壳寡糖COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-MGer3,与之前的研究相比产率提高4～7倍。紫外可见吸收光谱、傅立叶红外光谱、核磁氢谱、元素分析等表征手段表明产物成功合成,产物的取代度为0.260～0.283;溶解性、X-衍射和热稳定性研究表明,与香叶醇相比产物在酸性和中性条件下有较好的溶解性;相较壳寡糖,产物的结晶度较强而热稳定性较差;平板抗菌结果表明衍生物COS-M-Ger1、COS-M-Ger2和COS-M-Ger3的抑菌性优于壳寡糖和两种市售抗菌剂;本研究为溶解性好、高效抗菌的壳寡糖衍生物的大批量生产提供理论研究基础。     

海洋生物新材料壳寡糖在动物领域研究现状及应用前景

壳寡糖是自然界中唯一存在的天然碱性多糖,是壳聚糖的降解产物,聚合度一般在2~20。壳寡糖无毒,易生物降解,而且具有独特的生物活性,被广泛应用于医药、食品、保健品、饲料养殖、日化等行业。阐述了壳寡糖的制备方法、生理功能、作用机制的研究现状及其在动物生产中的应用前景。     

利用Pseudoalteromonas elyakouii菌株发酵法生产褐藻胶寡糖培养基的改进

利用Pseudoalteromonas elyakouii菌株发酵降解相对分子质量10000左右的褐藻胶，制备褐藻胶寡糖．为了达到降低培养基成本和简化分离工艺的目的，使用（NH4）2SO4为氮源的发酵培养基来代替使用蛋白胨为氮源的发酵培养基．为了促进菌的生长和发酵产物褐藻胶寡糖的生成，在新发酵培养基中分别添加海带浸液、葡萄糖、乳糖、几种氨基酸和几种代谢中间产物（丙酮酸、柠檬酸、延胡索酸、尿素），并考察这些成分对菌生长和发酵产物褐藻胶寡糖生成的影响．研究发现：在基本培养基中和添加0．1g／L的L-谷氨酰氨、0．1g／L尿素或0．1g／L柠檬酸时可获得较高的产物浓度。     

母乳寡糖的生物合成研究进展

母乳目前被认为是最好的婴幼儿营养剂,其和牛乳最重要的差别在于含寡糖的种类和结构的不同。现有很多研究证明了母乳寡糖(HMOs)在抵御胃肠道病原微生物感染和维持胃肠道微生态平衡方面具有非常重要的作用。迄今已有多种方法提取或合成HMOs,其中生物合成方法因不使用有毒试剂且方便大规模生产,而被用来合成多种HMO。生物合成HMOs的方法可分为两步——碳骨架的构建和岩藻糖基化或唾液酸化。目前合成HMOs的代谢途径大多在大肠杆菌内构建。对母乳寡糖作用机理与合成方法的研究,使其在未来作为婴幼儿奶粉中普遍的添加剂成为可能。     

己酸菌代谢调控发酵试验

己酸菌代谢调控发酵试验廖建民，唐玉明，姚万春，任道琼彭追远，崔利（四川省泸州市酿酒研究所；６４６１００）（四川省古蔺郎酒厂；６４６５２３）微生物发酵过程中，发酵条件既影响菌体的生长，又影响代谢产物的合成。微生物的发酵条件不同，合成的代谢产物数量和种类...     

大肠杆菌代谢工程生产芳香族化合物研究进展

芳香族化合物广泛应用于化工、食品及医药等领域,多来自于化工合成或天然产物提取。天然微生物也具有合成芳香族化合物的能力,以维持自身生命活动代谢需求,但其积累能力较低。近几年利用代谢工程的方法对微生物特别是大肠杆菌进行途径优化、设计、改造等方法在提高其芳香族化合物的发酵产量方面取得了显著成效,并且创新地生产出多种有价值的芳香族衍生物。这些研究成果对于未来以合成生物学和细胞工厂为基础利用可再生资源进行工业生物制造,解决化石能源危机和天然产物提取等问题具有重要意义。     

微生物代谢工程在花色苷生产过程中的应用现状和前景

随着微生物代谢工程技术在合成生物学等领域的广泛应用,该技术已被用于提取多种植物天然产物。花色苷是一种水溶性天然色素,能使花和果实着色,已被广泛应用于食品和化妆品行业。目前,花色苷主要从植物材料中提取,但是提取的花色苷具有纯度低和性质不稳定等缺点,因此利用微生物代谢工程技术替代传统方法提取花色苷具有重要意义。本文阐述了工程菌合成花色苷的研究进展,对酶的选择、运输调节、尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖供应量的调控以及工艺优化等方面进行综述。对花色苷合成代谢途径的了解将为实现微生物生产花色苷的产业化提供重要信息。     

2′-岩藻糖基乳糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究

2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)可作为益生元添加到婴幼儿配方奶粉中,对婴幼儿肠道菌群和免疫系统的发育至关重要。通过共表达L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(L-fucokinase/GDP-L-fucose pyrophosphorylase,fkp)基因和α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase,futC)基因,以大肠杆菌Escherichia coli BL21star(DE3)为出发菌株,异源表达脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)来源的fkp和futC基因,建立了2′-FL的合成途径。通过CRISPR/Cas9系统敲除β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(UDP-glucose lipid carrier transferase,WcaJ)基因,阻断中间代谢产物的分解,探究该类基因对2′-FL合成的影响。实验结果显示:单敲除LacZ基因促进2′-FL的产量并提高1.88倍,对菌体生长影响不显著;叠加敲除基因LacZ和WcaJ后,2′-FL的产量提高4.89倍,且对菌体生长没有显著影响。通过摇瓶发酵优化,确定了发酵条件为:采用限定性培养基(DM培养基),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导温度为25℃,接种量为5%。在此条件下摇瓶培养,2′-FL产量最高可达1.44 g/L。研究表明敲除β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因可显著提高2′-FL产量,为扩大其工业化生产提供参考依据。     

产壳聚糖酶菌株的筛选及壳寡糖性质的研究

采用透明圈法筛选，从天然土样中获得产壳聚糖酶的野生菌株6株。将其中一株高产壳聚糖酶的微生物菌株命名为BK2。用发酵酶液降解壳聚糖，制备壳寡糖。壳寡糖的抑茵性和溶解性，研究结果表明，壳寡糖对一些常见细菌、霉菌、酵母菌等微生物的生长均有不同程度的抑制作用，它在微酸性的条件下，溶解性及抑菌性较好。