携带ocf 4、klf4、sox 2、,nanog 4种转录因子的腺病毒载体的构建

构建并鉴定携带人oct4、klf4、sox2、nanog 4个基因的腺病毒栽体,重组出能同时表达这4种转录因子的腺病毒.为进一步诱导多能干细胞的研究提供新方法.使用口蹄疫病毒2A序列将人的oct4、、sox2、nanog 4个基因顺序连接,定向克隆至腺病毒载体pDC328上,并在nanog下游插入红色荧光蛋白dsRed2作为报告基因.利用酶切及PCR方法鉴定病毒载体的正确性;荧光显微镜下观察病毒感染HEK 293细胞24 h后红色荧光的表达,检测病毒功能;实时定量PCR检测细胞内4种基因的表达情况.结果表明,酶切后DNA电泳鉴定证实栽体构建成功,重组后病毒PCR显示病毒携带oct4、klf4、sox2、nanog 基因;荧光显微镜下观测到红色荧光的表达,实时定量PCR检测到细胞内4种基因的表达.本研究成功构建的腺病毒载体,能够介导以上4种转录因子在细胞内的同时表达,为进一步诱导多能干细胞的提供新方法.     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

红色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系建立及体内成瘤的初步研究

建立能够稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,并研究其在体内不同部位形成畸胎瘤的能力。构建含红色荧光蛋白(DsRed-Express)的表达质粒,并采用磷酸钙法包装成慢病毒转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)。筛选得到强阳性克隆,对其进行RT-PCR检测和裸鼠、C57小鼠体内成瘤实验验证细胞特性,最后获得稳定表达红色荧光的胚胎干细胞(Red-ESCs)。Red-ESCs能够表达多能性基因,如Oct4,Sox2,Nanog等,也能在裸鼠体内成瘤。不同部位的畸胎瘤在基因表达上有差异,其中肝部形成的畸胎瘤表达肝特性基因。成功建立稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,其在体内形成的畸胎瘤性质受到体内环境的影响。     

小鼠sox2基因的克隆及其原核表达载体构建

TAT穿膜肽能携带大分子物质进入细胞。NLS核定位信号肽是能帮助亲核蛋白进入细胞核的短肽。SoxB1家族的SOX2是维持ES细胞全能性的重要转录因子。通过RT-PCR方法从小鼠胚胎干细胞中克隆得到小鼠sox2基因,将其与穿膜肽基因tat和核定位信号基因nls融合,利用原核表达载体进行融合蛋白表达,并将表达的蛋白纯化、复性得到复性蛋白,为今后对SOX2蛋白的功能及生物学活性展开研究奠定了基础。     

昆虫杆状病毒表达egfp载体构建及鉴定

用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ将目的基因片段6His-11R-eGFP从载体pDC316-6His-11R-eGFP上酶切下来,并将该目的基因片段与供体载体pFastBacl连接构建供体质粒pFastBacl-6His-11R-eGFP;将其转化大肠杆菌(Escherichua coli)DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBac-6His-11R-eGFP,PCR鉴定得到单一目的基因条带.将该病毒载体转染Sf9细胞,进行病毒包装,在倒置荧光显微镜下观察蛋白表达,并以荧光定量PCR方法测定病毒滴度.     

AFP调控的携带Mn-SOD基因的腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

利用改造后的溶瘤腺病毒Ad.enAFP-E1A-△E1B55Kd作为载体携带治疗基因Mn- SOD,得到目的病毒Ad.enAFP-E1 A-△E1B55Kd-MnSOD;通过PCR方法鉴定病毒构建正确;MTT法检测病毒对肝癌细胞的特异杀伤能力和对肝正常细胞的安全性;Hoechst33342染色实验观察细胞凋亡的现象.结...     

靶向肝癌细胞的嵌合AAV建库及筛选

采用Shuffling的方法,将AAVl-9Cap基因序列进行改组,筛选出高效靶向肝癌细胞的嵌合AAV载体。以pAAV-MCS载体为骨架,构建出含从V2ITR和Rep2序列的pAdB载体,在此基础上,构建含有嵌合Cap序列的pARC载体库,用于转染293细胞,并加入5型腺病毒（Ad5）,包装出嵌合AAV病毒。然后将包装出的嵌合AAV病毒与Ad5共感染BEL7402肝癌细胞,经过三轮筛选后,初步筛选出可以靶向肝癌细胞的嵌合AAV。最后将筛选出的AAVRep2嵌合Cap基因的融合片段连接到pMDl8-T载体上,构建出pARC-T载体,与AAV-EGFP质粒共转染293细胞,并加入Ad5,包装出病毒基因组合EGFP基因、病毒外壳为嵌合Cap的AAV病毒（cAAV-EGFP）,并用其感染BEL7402细胞,观察绿色荧光的表达。最后观察到绿色荧光表达,证明筛选出了靶向BEL7402肝癌细胞的嵌合AAV。     

miR-29b对肝癌细胞中甲基化转移酶表达的调控作用

DNA甲基化异常在肿瘤发生中起着极为重要的作用,而基因组DNA的甲基化主要通过DNA甲基化转移酶(DNA methyhransferases,DNMTs)来完成。microRNA和甲基化转移酶的表达具有一定的联系。构建携带有miR-29b的腺病毒载体并包装病毒,鉴定正确后,将病毒感染肝癌细胞PLC,用qRT-PCR的方法检测miR-29b在PLC细胞中对甲基化转移酶表达的调控作用。结果表明,成功构建携带有miR-29b的腺病毒,qRT-PCR方法检测表明miR-29b能有效地调控甲基化转移酶的表达。     

携带pri-mir-20a的慢病毒表达载体的构建

采用PCR扩增获得的pri-mir-20a,过渡质粒pcDNA3.0-H1经BamH Ⅰ与Hin dⅢ双酶切后将两者连接产生pcDNA3.0-H1-pri-mir-20a重组质粒,再将PCR获得的H1-pri-mir-20a克隆到慢病毒载体pdc-SEW上获得重组慢病毒载体pdcH1-pri-mir-20a-SEW.将pCMV 8.91、pMD2.VSV.G、pdcH1-pri-mir-20a-SEW三质粒共转染293FT细胞,结果显示48 h后绿色荧光蛋白的表达达到80%,表明已成功构建出携带pri-mir-20a的慢病毒表达载体.该载体的成功构建为深入开展对miR-20a的生物学功能和靶标验证提供了有效的工具.     

结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板,将Ag85B和ESAT6编码基因进行PCR扩增,然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合,定向克隆至质粒Pvax1中,构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒Pvax1/AE.经单双限制性内切酶图谱、PCR产物及DNA测序分析等多种方法鉴定,证实Pvax1/AE真核表达质粒构建成功.为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

腺病毒介导的RNA干扰降低VEGF转录抑制血管形成的研究

用细菌内同源重组的方法构建了针对VEGF的siRNA表达重组腺病毒AdH1-siRNA／VEGF，感染HUVEC细胞，观察该病毒对HUVEC细胞体外增殖和形成微血管的干扰作用．通过Real—time RT—PCR实验表明，AdH1-siRNA／VEGF可特异性地下调血管内皮细胞（HUVEC）中的VEGF mRNA水平．与对照组相比，VEGF的mRNA水平下降为50％，AdH1-siRNA／VEGF对HUVEC细胞增殖有干扰作用．加入病毒9d后，对照组的细胞平均计数为31．5×10^4／μl，干扰病毒对照组为28×10^4／μl，AdH1-siRNA／VEGF干扰组为21．5×100／μl．AdH1-siRNA／VEGF对HUVEC细胞在Matrigel上形成微血管有干扰作用，对照组每HPF形成微血管数量为10．75条，干扰病毒对照组为10．25条，实验组AdH1-siRNA／VEGF每HPF形成微血管数量为7条．证明AdH1-siRNA／VEGF可以干扰血管形成．     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

小麦热激蛋白基因sHSP16.9植物表达载体构建

以小麦中国春热激蛋白基因sHSP1 6.9为材料,用PCR扩增的方法于目的基因片段5和3上分别添加Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ的酶切位点,然后与植物表达载体pCAMBIA Super-1300连接.用Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ进行双酶切验证,确定已将热激蛋白基因sHSP16.9连接到植物表达载体上,表达载体pCAMBIA Super-1300-TasHSP16.9构建成功.为验证小麦热激蛋白基因sHSP16.9的功能及转基因植物表达奠定基础.     

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。