HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。     

戊型肝炎病毒ORF2蛋白与新型融合标签Halo Tag的融合表达

目的在大肠杆菌KRX中表达戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF2与新型融合标签Halo Tag融合蛋白。方法采用RT-PCR法从4型HEV毒株中扩增ORF2基因部分片段(aa 382~620),插入含新型融合标签Halo Tag的原核表达载体pFN18the中,构建重组表达质粒pFN18the-ORF2,转化大肠杆菌KRX,鼠李糖诱导表达Halo-ORF2融合蛋白,纯化后Western blot分析融合蛋白的反应原性。结果经RT-PCR扩增出717 bp的目的基因片段;重组表达质粒pFN18the-ORF2经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白Halo-ORF2相对分子质量为57 900,表达量约占菌体总蛋白的15%,以包涵体形式表达,纯化后纯度达90%以上,可与HEV IgG阳性血清特异性结合。结论在大肠杆菌KRX中表达了Halo-ORF2融合蛋白,为HEV结构蛋白抗原表位的筛选及戊肝血清学诊断的研究奠定了基础。     

Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的 获得高纯度的Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白.方法 以Vif/VR1o12质粒为模板,PCR扩增出Vif-△N28基因并插入pRSETB质粒.将构建的原核表达载体Vif-△N28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性.结果 所表达的Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上.结论 已成功构建了Vif-△N28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白.     

HIV-1 HXB2株蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达、纯化HIV-1型HXB2株蛋白酶(Protease,PR),用于对HIV-1GagP2/NC蛋白酶切割位点序列随机突变的噬菌体展示文库的切割筛选。方法根据HIV-1HXB2株PRDNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1PR的DNA编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体进行测序。将HIV-1PRDNA克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE鉴定,并用HIV阳性血清进行免疫反应性的鉴定。结果合成的使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1PR的DNA编码序列,经测序显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。所构建的HIV-1PR原核表达质粒pQE30-pr,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为14000的HIV-1PR蛋白,纯化的目的蛋白浓度为7.74mg/ml。ELISA检测该蛋白与HIV阳性血清呈特异性反应。结论已成功合成并克隆了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1PR的DNA编码序列,经表达及纯化的HIV-1PR蛋白具有免疫学特性。     

产肠毒素性大肠埃希菌K99-987P-F41原核表达载体的构建、表达及其纯化

目的构建产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41原核表达载体,诱导表达后进行纯化。方法利用PCR技术,从ETEC基因组DNA中扩增出K99、987P、F41部分基因片段,将3段目的基因融合亚克隆至大肠埃希菌原核表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化。结果重组表达质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41经PCR、酶切及测序鉴定证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约60 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的63.8%,纯度为81.2%,浓度为8.953 mg/ml,可同时被天然和重组抗原多抗识别,具有良好的反应原性。结论 ETEC重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍离子亲和层析柱纯化可获得融合蛋白。     

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。     

结核杆菌Ag85A蛋白与日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶的融合表达与纯化

目的　对结核杆菌Ag85A抗原基因进行克隆、表达与纯化 ,为研制新型结核杆菌血清学诊断试剂奠定基础。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,经PCR扩增Ag85A抗原基因成熟肽编码区 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 λT中日本血吸虫谷胱苷肽硫转移酶 (GST)编码区下游构建重组质粒 ,经DNA测序鉴定后 ,转化大肠杆菌JM10 9株 ,IPTG诱导表达 ,采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化 ,SDS -PAGE和Westernblot鉴定重组表达产物。结果　PCR扩增获得了约 90 0bp的目的基因片断 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 -λT后 ,对重组质粒进行DNA测序发现 ,插入片段与GenBank中结核杆菌Ag85A抗原基因成熟肽编码区同源性为 99 .8%。重组质粒转化大肠杆菌后 ,经IPTG诱导表达 ,纯化的融合蛋白相对分子质量为 5 80 0 0 ,Westernblot检测该融合蛋白能与兔抗结核杆菌多价抗血清发生反应。结论　本研究为研制结核杆菌血清学检测试剂盒及相关分子免疫学研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达

目的　构建幽门螺杆菌粘附素 (hpaA)和霍乱毒素B亚单位 (ctxB)融合基因的原核表达载体 ,诱导表达并进行纯化。方法　用PCR扩增hpaA和ctxB两个目的基因片段 ,克隆至同一pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pQE hct,转化E .coliDH5α ,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT ;经Westernblot分析其免疫原性 ,采用镍离子柱进行纯化。结果　经测序HCT融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子质量约为 4 0 0 0 0。可溶性蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组融合蛋白。经Westernblot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论　已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达 ,为研制Hp口服疫苗提供依据     

中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

目的获得高质量的中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白抗原。方法改造表达载体,以构建中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白基因带有筛选标记的真核细胞表达质粒,将所构建质粒转染真核细胞,用含有抗性的培养基筛选出能够高效、持续表达包膜蛋白的稳定表达细胞株。结果所构建的表达载体pVRPEnv转染细胞后可表达目的蛋白,并建立了稳定表达细胞系。结论获得了可以高效、持续稳定表达中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白的细胞株。     

HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。     

HIV-1 Vif蛋白的体内表达及其生物学功能

目的分别构建带有6His和mbptag的HIV-1Vif基因真核表达载体,在体内表达融合蛋白,并检测其生物学功能。方法PCR扩增带有6His和mbptag的HIV-1Vif基因,克隆至真核表达载体VR1012上。将抗病毒因子APOBEC3G(A3G)分别与空载体VR1012、HIV-1野生型Vif/VR1012、Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012共同转染293T细胞,检测Vif-mbp和Vif-6His的表达,并进行A3G体内降解试验。将A3G和/或可产生病毒的质粒HXB2Neo△Vif分别与HIV-1野生型Vif/VR1012、Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012共同转染293T细胞,通过A3G包装进病毒和Magi细胞感染试验,进一步检测HIV-1Vif-mbp和Vif-6His融合蛋白的生物学功能。结果重组表达质粒Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012经双酶切鉴定证明构建正确。转染293T细胞48h后,Vif-mbp和Vif-6His融合蛋白均有表达,但表达的Vif-mbp有不同程度的降解。Vif-6His可降解A3G,使其表达量下降至10%左右,而Vif-mbp几乎不能降解A3G。Vif-6His可阻止A3G包装进病毒颗粒中,而Vif-mbp无此功能。Vif-mbp可使HXB2Neo△Vif病毒感染能力恢复至15%,而Vif-6His可使其恢复至86%。结论已成功构建了带有6His和mbptag的HIV-1Vif基因真核表达载体,表达的Vif-mbp融合蛋白影响了Vif的生物学功能,但Vif-6His融合蛋白不影响Vif的生物学功能。     

HIV-1 Tat蛋白的生物学特性及其致病效应

Tat蛋白是HIV-1编码的重要调控蛋白,在病毒复制和感染致病中起重要作用。在感染细胞内,Tat蛋白与多种细胞分子相互作用,启动病毒基因组的转录,促进转录延伸,从而激活和促进病毒复制;分泌和释放至细胞外的Tat蛋白,具有独特的穿膜功能,可到达宿主多个部位,作用于多种细胞,产生多样的Tat蛋白胞外活性,如参与免疫抑制、神经系统损伤及卡波济肉瘤形成等致病过程,被称为"病毒毒素"。本文对Tat蛋白的生物学特性及其致病效应作一综述。     

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵

目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b(+)-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础。     

Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的重组表达Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白。方法用PCR的方法从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入pMD18T载体,构建原核表达载体pET32aSIP,用BL21(DE3)/pET系统表达TrixSIP融合蛋白,SDSPAGE和质谱分析鉴定表达产物,并对表达蛋白进行初步纯化。结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中Ⅰa/c型GBS的SIP的基因序列同源性为99%。SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET32aSIP总蛋白中出现一条相对分子质量为66000的新蛋白带。质谱分析和蛋白质库的比较证实其为B族链球菌表面免疫相关蛋白(SIP)的可能性分数为74。结论已成功表达并初步纯化SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。     

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。