耐热嗜碱蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

碱性蛋白酶是一类重要的工业酶制剂。为进一步提高碱性蛋白酶在高温碱性条件下的活力,增强其工业应用价值,本文从地衣芽胞杆菌CCTCC M2018539中首先通过PCR扩增获得碱性蛋白酶编码基因aprE539并克隆入表达载体pND-113中,在枯草芽胞杆菌WB600中实现碱性蛋白酶AprE539的表达;重组酶AprE539经硫酸铵沉降(30%~70%)、透析、DEAE阴离子交换和超滤获得纯酶,并以SDS-PAGE电泳测定AprE539的分子量大小。结果表明,AprE539的分子量大小为30 kDa。进一步对其酶学性质研究表明:AprE539的最适作用pH为11.0,最适作用温度为65~70℃;在pH6.0~12.0范围内具有较好的稳定性;在60℃保温1 h后酶活剩余70%;Cu2+、Mn2+、Ca2+和Mg2+对酶活有明显促进作用。AprE539在氨基酸序列上仅有2个氨基酸残基与碱性蛋白酶2709存在差异,但其酶学特征差异明显,为后续进一步探究其酶学性质差异性奠定基础。     

宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析

利用宏基因组文库方法,通过功能筛选法从文库中筛选到一个新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238（GenBank：KU320675.1）,对新基因进行生物信息学分析和原核表达,并研究其酶学性质。结果表明,该基因全长2238bp,可编码745个氨基酸,通过氨基酸序列分析,预测bgl2238蛋白分子质量为80.67kDa,pI值为4.95,是一种结构较稳定、疏水性高且无信号肽序列的酸性蛋白质;经同源性分析,发现其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶具有58%的相似性,属于GH3超家族和GH3C超家族酶。将重组质粒pET-32a（＋）-bgl2238转化入Escherichia coli BL2l（DE3）细胞进行异源表达,酶学性质测定结果显示,以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG）为底物,β-葡萄糖苷酶bgl2238最适反应pH值和温度分别为6.10、44℃,此时该酶最大比活力达到29.1U/mg;且在4～50℃范围内,热处理β-葡萄糖苷酶bgl22384h后仍保留70%以上的酶活力,热稳定性较好;其动力学参数Vmax为576μmoL/（L·min）,Km为0.296mmol/L;不同浓度的K＋、Na＋、Fe2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋、Co2＋和Ni2＋对酶活力均有较大促进作用,其中Fe2＋对bgl2238酶活力的促进作用最大,10mmol/LFe2＋使相对酶活力高达260%,而重金属离子Ag＋、Hg2＋及Cu2＋对酶活力有抑制作用。bgl2238具有良好的酶学性质,可以尝试应用于工业上纤维素降解的生产。     

特基拉芽孢杆菌精氨酸酶基因的重组表达及酶学性质

精氨酸酶是一种能够催化精氨酸生成尿素和L-鸟氨酸的碱性水解酶。利用分子克隆的方法得到特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）PanD37的精氨酸酶基因,在大肠杆菌中异源表达该基因后分析重组酶的性质。结果表明：该精氨酸酶编码297?个氨基酸序列;酶的最适反应温度为45?℃,最适反应pH值为10.0,在pH?8.0～10.0及50～60?℃范围内酶活力稳定,Mn2＋、Ni2＋、Co2＋对酶活力有明显的激活作用,粗酶的活力可达1?109.8?U/mL。     

冬枣果实苯丙氨酸解氨酶酶学特性的研究

研究了冬枣果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶学特性。L-苯丙氨酸为枣果实PAL的反应底物,结果表明,最适底物浓度为1.0 mmol/L。枣果实PAL属于别构酶,具有2个米氏常数,Km分别为0.115×10-4、8.177×10-4 mol/L。枣果实PAL最适温度为50℃,最适p H为8.8。在浓度为0~4.0 mmol/L范围里,L-半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸均对枣果实PAL活性有一定的抑制作用,而抗坏血酸和蔗糖对PAL有激活作用。金属离子对PAL激活作用由强到弱依次为:Cu2+Fe3+Fe2+Na+;金属离子对PAL抑制作用由强到弱依次为:Al3+Mg2+Mn2+Ca2+Zn2+K+。研究结果揭示了冬枣果实PAL酶学特性,为通过调控枣果实PAL酶活性改善果实贮藏特性提供了理论依据。     

新型碱性低分子量β-葡萄糖苷酶基因的分离与酶学性质研究

目的:获得新型β-葡萄糖苷酶编码基因,并对其表达产物进行酶学性质研究。方法:采用宏基因组学方法提取兔盲肠内微生物总DNA,构建DNA文库,通过筛选培养基获得产β-葡萄糖苷酶的克隆,测序获得其插入基因序列,氨基酸多重序列比对分析其序列特征,并用DNS显色法测定表达产物在不同条件下的酶活力。结果:在文库中获得一个基因片段nglu07,能编码一个低分子量的β-葡萄糖苷酶。nglu07基因片段长180bp,编码60个氨基酸残基。与已提交的糖苷水解酶Ⅰ家族成员进行氨基酸多重序列比对表明nglu07具有预测的活性位点Glu4与底物结合位点Tyr47,其最适反应温度为50℃,最适pH为10.0,粗酶活为8.12U/mL。结论:成功获得一新型低分子量的碱性β-葡萄糖苷酶编码基因,其蛋白温度稳定性高,在pH4.0～11.0的环境中均能保持较高的酶活力,具有作为食品工业用酶以及碱性酶的潜力,尤其在食品饮料加工、棉织品生物整理、洗涤及废纸脱墨等工业方面具有一定的应用价值。     

基于宏基因策略的新颖木聚糖酶基因cbxynA克隆及其重组酶酶学性质

研究构建了库容量约为1.3×104个克隆子且外源片段的总长为30 Mb的土壤宏基因组文库。基于功能策略,从文库中筛选到分解木聚糖底物的阳性克隆子。该克隆经序列分析发现一个822 bp的潜在的编码木聚糖酶基因(cbxynA)的开放阅读框,其编码的氨基酸序列与来自古细菌属编码的木聚糖酶的相似度最高仅为45%,说明该序列为一条未知的新序列。cbxynA在大肠杆菌中的重组表达产物的分子质量为29 ku,与预测结果一致。对其原核表达条件进行优化,结果表明:质粒在培养5 h后加入0.7 mmol/L IPTG,23℃下诱导25 h后表达,木聚糖酶活力为52 U/mL,较初始值提高4.3倍。而重组酶(CBXYNA)最适pH和最适温度分别为5.2和55℃。金属离子Na+、K+、Li+、Ca2+能提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+能抑制其活性。该酶以水溶性玉米芯木聚糖、燕麦木聚糖、水不溶性木聚糖为底物时,其相对酶活力分别为162%,139%,74%。     

Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及其酶学性质

本文利用大肠杆菌原核表达系统对来源于Geobacillus thermodenitrificans的α-半乳糖苷酶编码基因进行了重组表达,并对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明,该α-半乳糖苷酶的分子量为100~110 kDa,以pNPG为底物时,该酶的最适反应温度为70 ℃,最适pH6.0,且该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性;Hg+、Ag+、Cu2+离子能完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,Fe3+、Mn2+、Zn2+等离子对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用;以pNPG为底物测得该酶的米氏常数K_m=10.04 mmol/L,最大反应速度V_max=18.25 μmol/min。     

一株产高活性多酚氧化酶菌株筛选鉴定及其酶学性质

采用变色圈法从土壤样品中分离筛选产多酚氧化酶的菌株,对其进行形态学观察、分子生物学鉴定,并对其所产多酚氧化酶的酶学性质进行研究。结果表明,筛选得到1株产多酚氧化酶活性较高的菌株,命名为ZL-2,其被鉴定为竹黄菌属（Shiraia sp.）。菌株ZL-2发酵8 d产多酚氧化酶酶活最高,达到521 U/mL。菌株ZL-2产多酚氧化酶最适底物为邻苯二酚,其最适pH值为6、最适温度为30 ℃;酶活在温度20～40 ℃及pH 3～6范围内稳定。金属离子Cu2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+对多酚氧化酶都有激活作用,其中Cu2+激活作用最强;Ca2+、Al3+对酶活有一定抑制作用;L-抗坏血酸和亚硫酸氢钠对该酶抑制作用较强。     

壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp. MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903 bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶（BUT）属糖苷水解酶46家族（后简称GH-46）,与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a（+）连接构建重组质粒pET-21a-BUT,转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa,DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45 ℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn2+对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。     

芋头多酚氧化酶的酶学性质研究

以邻苯二酚为底物,采用分光光度法研究了芋头多酚氧化酶(PPO)的酶学特性。结果表明:芋头PPO的最适温度pH为7.5,最适温度为40℃;90℃高温处理2 min,可使酶完全失活;PPO催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km=0.0221mol/L,Vmax=46.08 U/min;4种抑制剂对PPO活性均有不同程度的抑制作用,抑制效果由强到弱顺序为:抗坏血酸>亚硫酸氢钠>L-半胱氨酸>柠檬酸;金属离子Sn2+对PPO活性具有较强的抑制作用,A13+、Cu2+、Mg2+、Ca2+和Co2+对PPO活性有一定的抑制作用,Zn2+对PPO活性具有激活作用,Fe3+、Fe2+和Mn2+对PPO活性几乎没有影响。