一种基于双重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法

将低价肉类原料掺入高价肉制品是一种典型的肉类掺假方式，为准确鉴别牛肉及牛肉制品的真伪，建立一种基于双重微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）的牛源性成分定量分析方法。通过对14 种动物的Beta-actin单拷贝基因序列进行分析，设计牛源性特异性引物、探针与动物源性成分通用引物、探针并建立双重ddPCR体系，推导出牛源性成分质量与其特异性扩增拷贝数之间的计算公式，对牛源性成分进行定量检测该方法得到牛源性成分质量M牛（mg）与其特异性扩增拷贝数浓度C牛（copies/μL）之间的计算公式为M牛=0.033C牛＋2.37，对已知牛肉质量的混合肉样品与不同部位的牛肉样品进行检测，结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致。同时拷贝数相对含量可辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假。对市售样品的检测发现，存在目标肉样含量不达标以及不同程度的动物源性成分等掺假现象，说明该检测方法可为牛肉制品掺假量化判定和混合源性产品分级鉴定提供技术支撑。     

木聚糖酶诱导特异性产物生成的机制

木聚糖经酶法制取的高附加值功能低聚糖,是富含半纤维素材料的农业废弃物再生利用的有效增值途径,具有巨大的经济效益和环保意义。目前酶法生产低聚木糖中因特异性功能成分产率低而难以实现大规模工业化生产。解决这一问题亟需探究木聚糖酶如何催化生成特异性低聚木糖产物的分子机制。基于此,探讨了目前针对木聚糖酶与底物在结合方式和催化机理方面的研究,结合木聚糖酶的氨基酸序列和空间结构,综合分析影响木聚糖酶水解底物产生特异性低聚木糖产物的相关机制。     

多重PCR同时检测食品中4 种细菌与常见霉菌

建立一种同时检测食品中金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7以及霉菌的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）、沙门氏菌的侵袭正调节蛋白基因（hilA）、大肠杆菌O157:H7鞭毛基因（flic）、单核细胞增生李斯特氏菌的毒力调控蛋白基因（prfA）及霉菌18S?rRNA基因V5区分别设计5?对特异性引物,并对PCR扩增反应体系和扩增条件进行优化,确定获得特异性良好的PCR扩增产物。而后在37?℃对人工污染致病菌的香肠、面包和豆腐进行增菌培养,5?种致病微生物在20?h内的检出限均可达到100?CFU/25?g。本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中4?种细菌与常见霉菌的同时检测,相较于传统检测方法,具有快速、简便、特异性高的优点。     

酸性蛋白酶对酸肉发酵过程中菌群结构和风味品质的影响

为改善酸肉的生产工艺,研究商品化酸性蛋白酶对酸肉发酵过程中菌群结构、理化特性和风味品质的影响,利用高通量测序技术分析酸肉发酵过程中细菌和真菌群落组成。结果表明,蛋白酶的添加影响了酸肉发酵过程中乳杆菌、芽孢杆菌和葡萄球菌的相对丰度,降低了真菌的丰富度,并提高了酸肉中游离氨基酸总量。气相色谱-质谱分析结果表明,蛋白酶的添加提高了成熟酸肉中醇类、酸类、酯类、酮类和醛类物质的种类和含量。相关性分析结果显示葡萄球菌属与3-羟基-2-丁酮含量呈显著正相关,芽孢杆菌属与1-辛烯-3-醇含量呈显著正相关。感官评定结果表明,蛋白酶的添加提高了酸肉的滋味、气味和总体可接受度。因此,酸性蛋白酶对酸肉的菌群结构和风味品质具有重要影响,研究结果为改善酸肉生产工艺提供了理论依据。     

乳杆菌发酵剂对酸肉挥发性风味成分的影响

分别采用植物乳杆菌、清酒乳杆菌和类植物乳杆菌作为发酵剂对酸肉发酵过程中挥发性风味成分的影响。 电子鼻分析结果表明,酸肉的整体风味随发酵时间的增加差异显著;利用固相微萃取-气相色谱-质谱技术对酸肉发 酵过程中的挥发性风味物质进行检测,结果表明,酯类物质的相对含量显著增加,且增加的主要是乙酯类物质,发 酵结束时,添加植物乳杆菌、类植物乳杆菌和清酒乳杆菌组酸肉的乙酯类物质相对含量（56%、53%和60%）均显 著高于对照组（47%）,说明乳杆菌发酵剂的添加有利于酸肉中乙酯类物质的形成;通过Heatmap聚类分析发现, 发酵结束时,添加乳杆菌发酵剂的3 组酸肉整体风味比较接近,但与对照组差异较大,说明乳杆菌发酵剂的添加影 响了酸肉的风味品质。此外,发酵过程中添加发酵剂的酸肉中乳酸菌数量增加较快,肠杆菌数量显著降低,这保证 了酸肉的食用安全性。     

传统自然发酵酸肉中细菌群落多样性与风味品质分析

为探讨传统自然发酵酸肉中细菌群落多样性与风味品质的关系,采用Ion S5 XL测序平台,对4 种传统自然发酵酸肉中细菌16S rDNA V3～V4区进行高通量测序,并结合电子鼻和固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS）分析等手段揭示酸肉细菌群落结构及其风味品质的相关性。结果表明,样品获得序列数平均为110?395?条。4?种酸肉样品中总体细菌群落包含11?个门,其中厚壁菌门占绝对优势,约占总细菌群落的83.73%～98.92%,其次是变形菌门和放线菌门。主要优势菌属为乳杆菌属、魏斯氏菌属和乳球菌属。利用SPME-GC-MS从酸肉样品中检测到的挥发性物质包括酸类、醇类、醛类、酯类、酮类、萜烯类等化合物共126?种。各样品之间的菌属丰度存在一定的差异性,其菌群组成与工艺密切相关,而菌群种类和数量影响产品风味。与传统方法相比,高通量测序得到的细菌多样性信息更接近于样品微生态,能够全面解析自然发酵肉制品酸肉的细菌多样性,为传统食品的现代化改造和质量安全控制提供科学支撑。     

链霉菌L10608来源木聚糖酶xyn-GH10/11基因的克隆与生物信息分析

基于菌株L10608所产天然酶水解木聚糖底物时具有良好的水解木聚糖底物特性,通过设计简并引物,经巢式PCR克隆得到L10608菌株木聚糖酶基因全长(xyn-GH10与xyn-GH11),并对其进行生物信息学分析。由分析可知酶xyn-GH10全长1 469 bp,分子质量:50.677 ku;理论等电点pI:7.98;预测该木聚糖酶的信号肽为MGIQALPRAAVRQKLRTPLPALAAGVLGLTAALVPPTNADA;该木聚糖酶蛋白序列具有明显的第10族糖苷水解酶的八叠桶型保守区域,且能编码一段由108个氨基酸组成的RicinB-lectin非催化结构域。木聚糖酶xynGH11全长729 bp;分子质量:24.003 ku;理论等电点p I:8.98;预测该木聚糖酶的信号肽为MHQDGSQQDRT QNPAPFGGLSRRGFLVGGTGAAALAAGSGLLLPGTAHAA。该木聚糖酶蛋白序列具有明显的第11族糖苷水解酶的"右手半握状"保守区域。xyn-GH10与xyn-GH11基因经原核表达后其中木聚糖酶xyn-GH10酶活为160 U/mL,木聚糖酶xyn-GH11酶活为55 U/mL。     

基于宏基因策略的新颖木聚糖酶基因cbxynA克隆及其重组酶酶学性质

研究构建了库容量约为1.3×104个克隆子且外源片段的总长为30 Mb的土壤宏基因组文库。基于功能策略,从文库中筛选到分解木聚糖底物的阳性克隆子。该克隆经序列分析发现一个822 bp的潜在的编码木聚糖酶基因(cbxynA)的开放阅读框,其编码的氨基酸序列与来自古细菌属编码的木聚糖酶的相似度最高仅为45%,说明该序列为一条未知的新序列。cbxynA在大肠杆菌中的重组表达产物的分子质量为29 ku,与预测结果一致。对其原核表达条件进行优化,结果表明:质粒在培养5 h后加入0.7 mmol/L IPTG,23℃下诱导25 h后表达,木聚糖酶活力为52 U/mL,较初始值提高4.3倍。而重组酶(CBXYNA)最适pH和最适温度分别为5.2和55℃。金属离子Na+、K+、Li+、Ca2+能提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+能抑制其活性。该酶以水溶性玉米芯木聚糖、燕麦木聚糖、水不溶性木聚糖为底物时,其相对酶活力分别为162%,139%,74%。     

应用多重PCR快速鉴定自然发酵肉制品中6 种葡萄球菌

肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、木糖葡萄球菌（S. xylosus）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、马胃葡萄球菌（S. equorum）和松鼠葡萄球菌（S. sciuri）是发酵肉制品中常见的葡萄球菌,为准确、快速地检测和鉴定这些菌种,建立6?种葡萄球菌的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法并进行验证。以上述菌种的gap、rpoB、SodA和SNc为靶基因,设计和筛选菌种特异性引物6?对,优化PCR体系,建立6?种葡萄球菌的多重PCR鉴定方法。实验结果显示多重PCR的基因组DNA检测灵敏度可达到4?pg,活菌检测灵敏度可达到2×102?CFU;采用建立的多重PCR方法对传统肉制品中分离的8?株葡萄球菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、生理生化鉴定结果一致。建立的多重PCR方法具有较高的种间特异性,可快速、准确地用于发酵肉制品中肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和腐生葡萄球菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。     

超声波辅助酶解法提取食用猪油工艺优化及胆固醇脱除

为开发猪油的提取新工艺,以猪脂肪组织为原料,采用超声波辅助中性蛋白酶酶解法提取食用猪油。在单因素试验的基础上,以猪油的提取率为考察指标,采用正交试验方法研究蛋白酶添加量、酶解时间、超声波功率和超声时间对猪油提取率的影响,并通过吸附条件的优化,研究β-环糊精、羧甲基纤维素及马铃薯变性淀粉3 种吸附剂对猪油胆固醇的脱除效果。结果表明：各因素对猪油提取率的影响从大到小依次为蛋白酶添加量＞酶解时间＞超声波功率＞超声时间;超声波辅助酶解提取食用猪油的最优工艺为蛋白酶添加量550 U/g、酶解时间80 min、超声波功率720 W、超声时间120 s,在此条件下,猪油的提取率为（95.14±1.65）%;3 种吸附剂对猪油胆固醇均具有明显的吸附效果,脱除能力依次为β-环糊精＞羧甲基纤维素＞马铃薯变性淀粉。