鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立

建立检测鸡肉中金刚烷胺的间接竞争酶联免疫吸附分析(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法。利用N-(1-金刚烷胺基)肼甲酰胺与乙醛酸合成新式金刚烷胺半抗原,采用活泼酯法将金刚烷胺半抗原分别与血蓝蛋白、牛血清白蛋白偶联合成免疫原和包被原,将所制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,并制备特异性识别金刚烷胺的单克隆抗体。ic-ELISA法经系统优化后,最佳包被原稀释倍数为80 000,抗体工作质量浓度为122.50μg/L,对金刚烷胺的IC50为0.69μg/L,检出限为0.21μg/L,在0.07～6.15μg/L之间线性良好,鸡肉样品中添加回收率为101.69%～108.71%,变异系数均低于15%,且实际样品检测结果与高效液相色谱-质谱联用测定结果相关性良好(R2=0.97),表明建立的ic-ELISA具有良好的准确度和可靠性。利用该特异性抗体建立的方法适用于实际鸡肉样品中金刚烷胺的快速检测。     

氯丙嗪抗体制备与酶联免疫吸附测定方法的建立

本研究针对动物性食品中违禁药物氯丙嗪残留问题,建立了针对氯丙嗪的酶联免疫吸附测定方法。首次通过以氯丙嗪为原料,先去甲基化合成N-甲基氯丙嗪,再与丙烯酸叔丁酯反应及水解等步骤成功合成了氯丙嗪半抗原（CPZ-H）。半抗原CPZ-H分别与OVA和BSA通过活泼酯法偶联合成包被原与免疫原,采用免疫原CPZ-H-BSA免疫新西兰大白兔成功制备了特异性的抗氯丙嗪的多克隆抗体。基于该抗体建立了快速测定氯丙嗪的间接竞争酶联免疫吸附测定方法（ic-ELISA）。通过优化ic-ELISA方法的最佳工作条件,确定包被原和抗体稀释倍数均为1:8000时效果最好,此时标准曲线的IC50为1.1 ng/mL,线性范围为：0.13 ng/mL~8.8 ng/mL。制备的抗氯丙嗪的多克隆抗体与其它氯丙嗪类似物无交叉反应,特异性好。本研究为今后高特异性氯丙嗪快速检测试剂盒的制备提供依据。     

氯霉素免疫检测方法的建立

采用碳二亚胺法(EDC)和混合酸酐法,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备氯霉素免疫原[CAP-HS-BSA]和包被原(CAP-HS-OVA)。经紫外和变性电泳(SDS-PAGE)鉴定,免疫原与包被原均制备成功,偶联比分别为1:16和1:17。利用免疫原免疫两只新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测氯霉素残留的方法。建立的ic-ELISA检测氯霉素方法的半数抑制浓度(IC50)为7.275ng/ml,通过对氯霉素琥珀酸钠和链霉素、青霉素及庆大霉素的交叉反应率的测定,结果显示抗体对氯霉素琥珀酸钠有较高的交叉反应率而对链霉素、青霉素和庆大霉素的交叉反应率均小于0.1%。     

呋喃西林代谢物半抗原的制备及其免疫检测中的应用

本研究为了克服现有SEM半抗原结构不含硝基端基团的不足,将SEM与4-(3-醛基-4-硝基-苯氧基)-丁酸衍生制备半抗原,保留了硝基端基团。然后,将制备的半抗原分别与BSA和OVA偶联制备SEM-BSA免疫原和SEM-OVA包被原。免疫原免疫BALB/C小鼠后,结合细胞融合技术制备单克隆抗体,并利用间接竞争酶联免疫分析法(ci ELISA)评价单克隆抗体的效价及特异性。结果显示,单克隆抗体可特异性识别SEM的2-硝基苯甲醛衍生物(2-NPSEM),效价达1:2560000。应用ci ELISA检测法,在0.05~4.05μg/L呈线性关系,检测限高达0.04μg/L,IC_(50)值为0.23μg/L,与结构类似物NPAMOZ、NPAOZ和NPAHD的交叉反应率分别为0.03%、0.02%和0.26%。本论文提供的SEM半抗原的设计和改造方法,为呋喃西林的代谢物SEM的高效检测提供了新思路和方法。     

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1 株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）方法。结果：在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%～111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论：成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。     

基于异源包被的 曲安奈德竞争酶联免疫检测方法

为监控曲安奈德的滥用情况,本研究建立了曲安奈德竞争酶联免疫检测方法。将曲安奈德(Triamcinolone acetonide,TCA)半抗原通过活泼酯法与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联获得曲安奈德完整抗原TCA-KLH;通过免疫小鼠、细胞融合及筛选获得一株能够稳定分泌抗曲安奈德的单克隆抗体细胞株,制备并纯化了腹水抗体。将TCA和地塞米松(Dexamethasone,DEX)半抗原通过活泼酯法分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联作为包被原,建立曲安奈德同源及异源的间接竞争酶联免疫分析方法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。在同源包被情况下,曲安奈德灵敏度为5.4 ng/mL,而DEX异源包下灵敏度为0.53 ng/mL。未观察该方法到对哈西奈德、布地奈德、安西奈德以外的其他糖皮质激素的交叉反应。在添加回收实验中,使用20%甲醇水溶液提取动物组织的添加回收率在75%~95%之间。该方法能有效应用于动物组织中曲安奈德的快速筛查。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定毒蘑菇中5种强毒性蘑菇毒素含量

目的建立超高效液相色谱-串联质谱法快速检测毒蘑菇中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽5种强毒性蘑菇毒素含量的分析方法。方法样品经甲醇/水(3:7, V:V)混合液超声提取,离心后取上清液过0.22μm微孔滤膜,C18色谱柱分离,超高效液相色谱-串联质谱仪上采用多反应监测正离子模式测定,外标法定量检测。结果蘑菇样本中检测出α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽4种蘑菇毒素,浓度分别为164、198、33、2208 mg/kg。结论本方法快速简便、准确,可用于因蘑菇毒素引起的食物中毒应急检测。     

间接竞争酶联免疫吸附测定水产品中的组胺残留

本文通过制备特异性识别组胺衍生物的多克隆抗体,建立了针对水产品中组胺的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。以组胺等为反应原料经三步化学反应合成组胺半抗原,采用活泼酯法将组胺半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联作为包被原和免疫原,用紫外扫描法进行鉴定,结果显示组胺半抗原与载体蛋白偶联成功。通过免疫新西兰大白兔制备组胺抗血清,采用辛酸-硫酸铵方法纯化血清获得了相应的特异性多克隆抗体。通过对ic ELISA系列反应条件的摸索,确定了各组分的最适工作条件。试验结果表明:该方法对于组胺的IC50为0.91 ng/mL,与组氨酸、N-酰基组氨酸、3-甲基组胺等多种类似物及其衍生物均无交叉反应,方法特异性良好;线性检测范围为0.1～8.1 ng/mL,检出限为0.10 ng/mL;按照10、20、30 ng/g的添加量添加组胺至鱼、虾和贝类样品中,测得其回收率为98.9%～130.1%。方法检测的准确性好灵敏度高,适用于实际水产样品中组胺的检测。     

米酵菌酸单克隆抗体的制备与鉴定

目的 建立鲜湿米粉中米酵菌酸(bongkrekicacid,BA)的免疫学快速检测方法,制备特异性识别BA的单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]法将BA半抗原与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin, BSA)和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)载体偶联,分别合成BA免疫原(BA-BSA)和包被原(BA-OVA),用BA-BSA免疫Balb/C小鼠,取免疫效果好的小鼠脾脏与小鼠NS-1骨髓瘤细胞进行融合。采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)进行筛选,筛选出能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞,利用有限稀释法进行亚克隆得到单株能稳定分泌所需抗体的细胞;采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水型抗体,通过酶联免疫吸附法测定纯化后的抗体效价。结果 成功合成了BA免疫原BA-BSA和BA包被原BA-OV...     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

该研究针对农(水)产品中氟乐灵农药残留的问题,建立了间接竞争酶联免疫分析方法,快速检测氟乐灵农药.利用3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯与仲胺侧链氨基反应合成半抗原2C,采用碳二亚胺法将半抗原2C与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联合成完全抗原.通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体PcAb-2C,基于间接竞争酶联免疫分析方法原理对...     

间接竞争酶联免疫法测定鱼体中的亚甲基蓝

目的 本实验旨在建立快速检测鱼体中亚甲基蓝的间接竞争酶联免疫分析方法。方法 以BSA载体蛋白,以天青C(Azure C)为半抗原,利用戊二醛法合成免疫原Azure C-BSA,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过对包被浓度、抗体浓度和二抗浓度等一系列实验条件的优化,建立检测鱼体中亚甲基蓝的间接竞争酶联免疫吸附方法(ic-ELISA)。结果 获得的多克隆抗体特异性强、灵敏度高,在5 -500 ng/mL范围内,线性良好,线性回归方程为y=0.3658x-0.1867 (R²=0.98),IC50为75.4 ng/mL,检测限为8.3 ng/mL,样品添加回收率为77.2%-79.3%,RSD为5.3 %-8.1 %。结论 该方法灵敏度高、特异性强,可用于鱼体中亚甲基蓝的快速检测。     

一种检测杂环胺类化合物的酶联免疫检测方法的建立

为了制备一种广谱性杂环胺抗体,并建立一种可以实现多种杂环胺同时检测的快速分析方法。以杂环胺2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)为原料,将其与丁二酸单甲酯酰氯(MCO)反应合成杂环胺半抗原,通过活化酯法将半抗原与蛋白偶联制备免疫原进一步制备多克隆抗体,最终建立间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA)。该方法灵敏度(IC₅₀,以MeIQx计)为81.16 μg/L,检测限(IC₁₅)为12.07 μg/L。方法对喹啉类杂环胺(IQ、MeIQ)、喹喔啉类杂环胺(IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx)以及吡啶类杂环胺(PhIP)具有相同的识别能力,交叉反应率均达到93%以上。油炸牛肉和肉松样品中杂环胺(MeIQx)添加回收率在91.18%~98.64%之间,检测结果与液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)有很好的一致性(R2=0.9927)。本文建立的酶联免疫分析方法可以实现喹啉类、喹喔啉类以及吡啶类杂环胺总量的检测,为热加工肉制品中杂环胺的检测提供了一种简单、准确的快速检测方法。     

毒死蜱单克隆抗体制备及icELISA检测方法优化

目的制备毒死蜱单克隆抗体,建立icELISA(间接竞争酶联免疫吸附方法)检测方法并对其进行优化。方法以毒死蜱为基础物质,制备半抗原CPF-H1和CPF-H2,偶联蛋白制备人工抗原,进而通过免疫、细胞融合、筛选得到特异性的单克隆抗体,建立毒死蜱的icELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。结果质谱鉴定结果表明毒死蜱半抗原制备成功;半抗原偶联蛋白,紫外全波长扫描鉴定人工抗原制备成功;免疫动物、细胞融合并制备单克隆抗体;建立了icELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:PBST为标准品稀释液,包被抗原最佳稀释倍数为1:1000,抗体最佳稀释倍数为1:1000,一抗反应最佳时间为40 min,二抗反应最佳时间为30 min,制得毒死蜱标准曲线,毒死蜱对抗体的IC_(50)为73-25 ng/mL,线性范围IC_(20)~IC_(80)为32.52~260ng/mL,LOD为19.34 ng/mL。结论本研究为毒死蜱快速检测技术奠定了理论基础,对保障人们的身体健康具有重要的意义。     

鸡、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺间接竞争ELISA检测方法研究

目的:建立一种检测鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺的间接竞争酶联免疫吸附方法（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA）。方法:本研究基于间接竞争酶联免疫方法的原理,在酶标板微孔中预包被偶联抗原,样本中含有的金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺与微孔中预包被的偶联抗原特异性地竞争酶标记抗体,催化底物显色,根据显色深浅来计算样本中金刚烷胺类药物的含量。结果:金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺的检测限分别为:0.57、0.42、0.41 μg/kg （鸡肉）和0.59、0.40、0.38 μg/kg （鸭肉）;定量限分别为0.85、0.63、0.69 μg/kg （鸡肉）和0.94、0.68、0.52 μg/kg （鸭肉）;添加回收率范围为67.0%~117.9%;日内变异系数6.3%~12.7%,日间变异系数8.1%~14.5%,且实际样品检测结果与HPLC-MS一致性较高（R2=0.9990）,表明该方法具有良好的准确度和精密度。结论:本研究建立的ic-ELISA方法适用于鸡鸭肉样品中金刚烷胺类药物残留的检测,方法的灵敏度高、稳定性好,可应用于批量样本的快速筛查,具有良好的实际应用价值。     

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for diniconazole in agricultural samples

Diniconazole hapten was synthesized and conjugated to bovine serum albumin (BSA) by the carbodiimide method to produce an immunogen and to ovalbumin (OVA) by mixed anhydride method to produce a coating antigen. Polyclonal antibody against diniconazole was generated by immunizing New Zealand rabbits with the immunogen. Under optimised conditions (20% methanol, 0.4 mol/L Na⁺, pH 7.5), an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) was developed for detecting diniconazole. The 50% inhibitory concentration (IC₅₀) was 0.071 ± 0.013 mg/L and the limit of detection (LOD) was 1.28 ± 0.80 μg/L. Triazole fungicide analogues of diniconazole were tested and did not obviously cross-react, except for uniconazole (2.25%). The recoveries obtained after addition of standard diniconazole to agricultural samples, including water, soil, pear, grape, tomato and wheat flour, ranged from 70% to 120%. The ic-ELISA developed could successfully be applied to analysis of diniconazole residues in agriculture samples.