Y群脑膜炎球菌多糖活化工艺的优化

目的优化Y群脑膜炎球菌多糖活化工艺,为A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗的研制奠定基础。方法分别以多糖衍化率和游离多糖含量为指标,按照三因素三水平正交试验,以不同的pH值、活化时间和活化剂加量对多糖进行活化后,与破伤风类毒素(TT)偶联,并经Sepharose4FF层析纯化后,对多糖-TT结合物进行各项生化检定、免疫原性检测及稳定性观察,确定最佳活化工艺,并对优化的工艺进行验证。结果以多糖衍化率为指标,可确定pH值和活化剂加量二因素对Y群脑膜炎球菌多糖的活化有显著影响(P<0.05),而以游离多糖为指标时,无法确定三因素对多糖的活化有显著影响(P>0.05),结合各项指标检测及稳定性观察结果 ,确定多糖活化最佳工艺为:在pH12条件下,向每mg多糖中加入等量活化剂,反应10min。采用优化的多糖活化工艺制备3批Y群脑膜炎球菌多糖-TT结合物,各项指标均符合多糖结合疫苗的常规质控标准。结论优化的多糖活化工艺可制备出游离多糖含量低、免疫原性高的Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物,结果具有重复性。     

C群和W_(135)群脑膜炎球菌发酵工艺的优化

目的优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量。方法在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100L发酵罐中放大发酵。结果在发酵过程中,DO在20%～40%范围内对多糖合成无明显影响;在pH6.6左右,培养温度37℃,有利于多糖合成;发酵中间补加葡萄糖可增加多糖合成,低速补糖较高速补糖更有利于多糖合成。C群脑膜炎球菌在100L罐中放大发酵,多糖产量可达5L罐水平。结论通过参数优化,确定了C群和W135群脑膜炎球菌的最佳发酵工艺。     

W135群脑膜炎球菌培养基优化

目的试验设计法优化W135群脑膜炎球菌培养基,以期提高荚膜多糖产量。方法配制流脑半综合培养基(1、2、3号)及改良TSB培养基,以W135群脑膜炎球菌为试验菌株,菌密度为响应值,采用全因子试验、最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析试验对碳氮比进行优化,采用正交试验对硫酸镁、氯化钙、L-胱氨酸、氯化铵、谷氨酸钠、硫酸亚铁6种培养基添加成分进行筛选及优化。结果 1号流脑半综合培养基确定为基础培养基;葡萄糖及酸水解酪蛋白为影响菌密度的主效应因素,两者的最适浓度为7. 84和10. 04 g/L;培养基6种添加成分对W135群脑膜炎球菌生长影响作用大小依次为硫酸镁、L-胱氨酸、硫酸亚铁、氯化铵、氯化钙、谷氨酸钠。优化的1号流脑半综合培养基不仅成分更加简单,且提高了W135群脑膜炎球菌密度。结论优化的培养基增加了W135群脑膜炎球菌密度,为荚膜多糖产量的提高奠定了基础。     

层析法纯化C群脑膜炎球菌多糖及其制备的多糖蛋白结合物的安全性和免疫原性

目的采用层析法纯化C群脑膜炎球菌多糖,以替代冷酚抽提法,并对制备的多糖蛋白结合物进行初步安全性和免疫原性评价。方法采用温和的表面活性剂去氧胆酸钠对C群脑膜炎球菌多糖进行前处理,并用Capto adhere和Capto DEAE阴离子交换凝胶柱串联,对多糖进行柱层析纯化,再通过脱盐去除残留的去氧胆酸钠,获得精制多糖。对缓冲液中的去氧胆酸钠浓度、缓冲液pH值、样品的前处理时间及离子交换流速进行优化,并对建立的层析纯化工艺进行放大,纯化3批多糖,按照《中国药典》三部(2010版)要求检测各项质控指标,并通过核磁共振-氢谱检测纯化后的多糖结构。将层析法和苯酚法纯化的多糖分别与破伤风类毒素结合,制备多糖蛋白结合物,对结合物进行异常毒性、小鼠急性毒性试验和免疫原性检测。结果经优化,确定缓冲液的去氧胆酸钠浓度为1.0%,pH值为8.0,样品前处理时间为6 h,离子交换流速为2.0 ml/min。放大工艺制备的3批C群脑膜炎球菌多糖各项检测指标均合格,多糖回收率均大于70%,明显高于苯酚法制备的多糖。核磁共振-氢谱显示,层析法与苯酚法纯化的多糖主要峰基本一致,层析法未改变多糖结构。层析法纯化的多糖制备的多糖蛋白结合物异常毒性试验合格,小鼠急性毒性试验结果与苯酚法纯化多糖制备的多糖蛋白结合物比较,差异无统计学意义(P>0.05),免疫小鼠后均具有良好的免疫原性。结论层析法分离杂蛋白操作简便,省时省力,工艺易于放大,且减少了对环境的污染,可替代苯酚抽提法用于C群脑膜炎球菌多糖的纯化。     

W135群脑膜炎球菌发酵培养条件的优化

目的优化W135群脑膜炎球菌发酵培养条件,提高荚膜多糖产量。方法通过30 L发酵罐培养W135群脑膜炎球菌,分析不同补加葡萄糖方式、发酵温度、接种量对发酵液中生物量和荚膜多糖产量的影响,优化培养条件;并对优化的工艺进行验证。结果 W135群脑膜炎球菌发酵培养优化条件为分批补加5 g/L葡萄糖,发酵温度为37℃,接种量为16%;2批W135群脑膜炎球菌精制多糖的核酸含量、蛋白含量、唾液酸含量、O-乙酰基含量、K_D值、回收率及多糖含量,均符合ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗质量标准。结论获得了更适宜W135群脑膜炎球菌的发酵培养条件,提高了荚膜多糖含量,为建立完整的发酵工艺奠定了实验基础。     

人血白蛋白琼脂培养基在A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌培养中的应用

目的比较A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌冻干菌种在羊血琼脂培养基和人血白蛋白琼脂培养基中的复苏培养效果,为人血白蛋白琼脂培养基代替羊血琼脂培养基进行复苏培养提供依据。方法将A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌冻干菌种分别接种至羊血琼脂培养基和人血白蛋白琼脂培养基中,待长满琼脂培养基后转至相同体积、相同成分的基础培养基中,培养过程中取样测定A600。结果 A、C群脑膜炎球菌在人血白蛋白琼脂培养基中复苏培养效果优于羊血琼脂培养基,而Y、W_(135)群脑膜炎球菌在人血白蛋白琼脂培养基与羊血琼脂培养基复苏培养中效果相当。结论人血白蛋白琼脂培养基能够很好地应用于A、C、Y、W_(135)群脑膜炎球菌的复苏培养。     

A、C、W_(135)、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的研制

目的研制A、C、W135、Y群脑膜炎球菌四价多糖疫苗,并采用新方法去除细菌内毒素。方法经细菌培养后,分别提取A、C、W135和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖,纯化后,采用超速离心和层析技术相结合去除内毒素,按一定的配比制成四价多糖原液,加入保护剂,制成冻干疫苗,并进行检定。结果所研制的A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗各项指标均达到了质控标准,内毒素含量小于10EU/μg,具有良好的安全性及有效性。结论已成功制备了A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗。     

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的研制A+C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗。方法A群和C群脑膜炎球菌多糖在溴化氰(CNBr)的活化下,以1,6己二酰肼(ADH)作为连接子,与精制破伤风类毒素(TT)在碳二亚胺(EDAC)作用下结合,再按一定的比例将两者混合,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂冻干后,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果经检定,A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗各项指标均达到了质控标准。该疫苗安全性及免疫原性良好。结论已成功研制出冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,该制备工艺是可行的。     

超滤法纯化C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的工艺优化

目的优化超滤法纯化C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的工艺。方法以截留分子量为300 000的超滤膜对C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物进行超滤分离,以膜通量和多糖回收率为评价指标,优化方法中的超滤膜材质(300 k Da的聚醚砜膜和再生纤维素复合膜)、透析次数(1~6次)、超滤缓冲液(0.15 mol/L Na Cl、0.5 mol/L Na Cl、50 mmol/L的PBS和H2O)、多糖初始溶解浓度(0.25、0.5和1 mg/m L)和超滤方式(浓缩补液超滤和恒体积超滤)。采用最佳条件对C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物进行检测。结果 C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的最佳超滤条件为:以再生纤维素复合膜为超滤膜,0.15 mol/L Na Cl为超滤缓冲液,透析次数为5次,多糖初始溶解浓度为1.0 mg/m L,超滤方式为浓缩超滤。该方法可有效去除C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物中较大分子量的多糖组分,多糖回收率在80%以上,且可在一定程度上降低多糖水解物的内毒素含量。结论成功优化了超滤法纯化C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的工艺,显著提高了工作效率。     

层析法纯化脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖工艺的建立

目的建立一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺。方法将A、C、Y、W135群粗糖样品溶解后,用含2%脱氧胆酸钠(SDC)的Tris-HCl缓冲液稀释,用串联的Capto Adhere和Capto DEAE介质,采用流穿模式,经一步层析将多糖与其他杂质分离,再经Sephodex G25脱盐后获得精糖原液,根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对各型样品的各项指标进行检测。结果 4群多糖均可在柱上流穿,多糖可与蛋白及核酸完全分离;纯化多糖样品的各项指标均符合《欧洲药典》标准,各群多糖的回收率均高于55%。结论建立了一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺,缩短了生产时间,提高了回收率,可替代传统的苯酚抽提工艺,用于脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖的纯化。     

Triton X-114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素

目的采用Triton X-114萃取法去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素。方法1% Triton X-114与多糖溶液在0℃混合均匀,分别加热至25、37和56℃,观察分层情况。离心后收集上层水相,对其中残余萃取剂Triton X-114进行去除方法的选择。比较多糖浓度对萃取的影响及二次萃取的效果,并对终产物进行全面检定。对W135群和Y群脑膜炎球菌多糖进行萃取效果比较。结果最终选择56℃10min作为升温条件,3000r/min离心10min后,上清中多糖的内毒率含量均减少85%以上,多糖回收率不低于80%。残余的Triton X-114选择透析法去除。多糖浓度越低,越易于萃取。二次萃取多糖回收率大于85%。内毒素含量可降低至0.706EU/μg多糖。经检测,终产物多糖的相对分子质量未发生改变,免疫原性与萃取前差异无显著意义,异常毒性、多糖及内毒素含量合格。蛋白含量稍有增加,核酸含量降低。W135群和Y群脑膜炎球菌多糖的萃取结果与A群多糖相似。结论Triton X-114萃取法可以用于去除脑膜炎球菌多糖中的内毒素。     

B群脑膜炎奈瑟菌疫苗的研究进展

随着A、C、W135、Y群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides,Nm)多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的接种使用,相应菌群引起的流行性脑膜炎的发病率和死亡率均得到有效控制,而B群等其他群别引起的流行性脑膜炎发病率有所增加。因B群Nm的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)或多糖-蛋白结合物免疫原性均较低,目前采用常规方法尚未生产出有效的B群Nm疫苗。本文对B群Nm CPS疫苗、外膜囊泡(Out membrane vesicles,OMV)疫苗、脂寡糖(Lipooligosaccharide,LOS)疫苗和重组蛋白疫苗的研究进展作一综述。     

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定W135群和Y群脑膜炎球菌多糖中半乳糖和葡萄糖含量

目的采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培法(High-performance anion-exchange chromatography with pulsedamperometric detection,HPAEC-PAD)测定W135群和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖中半乳糖和葡萄糖的含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法多糖蛋白结合物原液的混合液经HCl水解处理后,进样CarboPac PA10柱,以氢氧化钠-醋酸钠梯度流洗,脉冲积分安培检测器检测。筛选样品的水解条件;对HPAEC-PAD法进行专属性、精密性及准确性验证,并进行初步应用。结果确定的样品水解条件为以2 mol/L HCl于85℃处理1 h。载体蛋白破伤风类毒素对检测结果无干扰;重复性、日内精密性和不同操作者之间精密性试验结果的RSD均小于5%;准确性试验中葡萄糖和半乳糖的回收率在90%～110%之间。HPAEC-PAD法测定多糖蛋白结合物原液的多糖含量与传统间苯二酚比色法测定结果相当;成品疫苗中的W135群和Y群多糖含量测定结果符合《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》的规定(均≥4μg/剂)。结论 HPAEC-PAD法专属性、精密性和准确性良好,可用于A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗中W135群和Y群多糖含量的测定。     

伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

目的优化伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。方法采用DEAE离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为6.0、7.0和8.0的条件下纯化1批伤寒Vi多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法进行比较。按《中国药典》三部(2010版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小及内毒素含量,并计算样品的多糖回收率。采用优化的DEAE柱层析纯化工艺纯化3批伤寒Vi多糖粗糖,验证该工艺的稳定性。结果 DEAE离子交换柱缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为7.0和8.0时,可有效将伤寒Vi多糖的杂质与纯化产物分离,多糖回收率分别为36.52%和38.35%,明显高于传统工艺的多糖回收率(15.52%),且纯化产物的内毒素含量(10 EU/μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7.0)纯化3批伤寒Vi多糖粗糖获得的6批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%。结论优化了伤寒Vi多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性良好,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi多糖的纯化。     

冻干A、C、W_(135)、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～8℃保存的稳定性。方法将冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗放置在2～8℃条件下30个月,定期取样,观察其物理外观,进行鉴别试验,并测定多糖含量、分子大小、水分含量、异常毒性等质量控制指标,评价疫苗质量的稳定性。结果冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗于2～8℃30个月保存,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～8℃保存,其质量稳定。     

19F型肺炎链球菌菌种的复壮及其荚膜多糖纯化工艺的优化

目的开发复壮肺炎链球菌19F型(Sreptococcus pneumoniae serotype 19F,简称PN19F)菌种的方法,并优化其荚膜多糖的纯化工艺。方法配制PN19F菌种用液体扩增培养基和固体选择培养基,筛选出荚膜较厚的单菌落,比较复壮前后PN19F菌种的发酵培养情况、纯化后多糖收获量及多糖质量;将发酵液裂解后分别酸沉淀8、24和48 h,并经100 KD超滤纯化,再分别用乙醇法和冻干法制备精制多糖,比较其多糖收获量、组分检定结果、抗原活性、核磁共振图谱。结果两种培养基复壮前后的PN19F菌种,发酵收获菌液A600值及培养时间变化不大。纯化后多糖收获量分别为0. 2和0. 6 g/L,即复壮后多糖收率提高了195%。酸沉淀8、24 h后纯化的多糖质量合格,且24 h较8 h多糖收率高约38%,酸沉淀时间达48 h时,产率无明显变化,但多糖质量不合格。乙醇法和冻干法制备的精制多糖各项指标均合格,且无明显差异。结论应用制备的两种培养基复壮的PN19F菌种,可明显提高荚膜多糖产量。PN19F菌种的酸沉淀时间不超过24 h,乙醇法和冻干法均可用于精制多糖制备。     

脑膜炎球菌W135群多糖含量和分子大小双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis,Nm)多糖疫苗(Groups A,C,Y,W135 menig-nococcal polysaccharide vaccine,MPV4)中W135群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法,并进行初步应用。方法以抗W135群Nm多克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法,采用棋盘滴定法筛选包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度,对W135群Nm多糖进行特异性定量测定,并验证线性关系的重复性;对建立的ELISA法进行特异性、准确度、精密度及定量限的验证;采用建立的ELISA法检测10批W135群Nm多糖样品和10批无关流脑多糖样品,进行W135群Nm多糖的鉴别试验;采用建立的ELISA法测定MPV4多糖含量、多糖分子大小和回收率。结果经棋盘滴定法确定双抗体夹心ELISA法的最佳包被抗体工作浓度为10μg/ml,最佳酶标抗体工作浓度为1∶15 000稀释,W135群Nm多糖在2.5~20 ng/ml浓度范围内剂量反应曲线线性关系良好,相关系数大于0.99。采用建立的双抗体夹心ELISA法检测W135群Nm多糖为强阳性,检测其余样品的结果均为阴性;试验内及试验间测定16、8、4 ng/ml W135群Nm多糖含量的变异系数在1.1%~9.0%之间,回收率在87.5%~105.0%之间,定量限为4 ng/ml;检测W135群Nm多糖的阳性符合率和无关多糖的阴性符合率均为100%。采用该法测定3批MPV4中W135群多糖含量、分子大小及回收率均符合申报MPV4疫苗暂行规程关于W135群Nm多糖的质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4中W135群多糖含量和分子大小的测定。