人巨细胞病毒pp65 IgG-AI快速诊断试剂的临床应用

目的评价人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)pp65 IgG-亲和力指数(Avidity index,AI)快速诊断试剂的临床应用价值。方法以自制的截短pp65重组蛋白作为诊断试剂,对本室血清库中保存的标本,采用ELISA间接法检测其特异性IgG抗体,分析该试剂的灵敏度、特异性和准确度。检测临床收集的89份患者血清标本(其中5例被明确诊断为HCMV活动性感染)的pp65 IgG抗体,并与意大利DIESSE公司IgG检测试剂盒结果进行比较。同时,对pp65 IgG阳性标本,运用尿素变性ELISA间接法检测其AI值,与意大利DIESSE公司IgM检测试剂盒结果进行比较,评价AI检测在HCMV感染诊断中的价值。结果用pp65快速诊断试剂检测阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,灵敏度、准确度和特异性均达100%。两种诊断试剂IgG抗体检测结果,差异无显著意义。pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI<60%标本共41份,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测IgM为阳性的仅有1份。临床明确诊断为HCMV肺炎的患者血清标本,诊断试剂检测AI值为可疑阳性,但参比试剂检测HCMV IgM抗体为阴性。结论pp65 IgG-AI快速诊断试剂可初步诊断HCMV感染,简单快速,重复性好,具有良好的临床应用前景。     

水痘带状疱疹病毒IgG抗体检测试剂国家参考品的研制

目的制备水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)IgG抗体检测试剂的国家参考品。方法利用国内外5个厂家ELISA试剂和膜抗原免疫荧光抗体检测(fluorescent-antibody-to-membrane-antibody,FAMA)试验,对候选样本进行筛选,确定水痘检测试剂国家参考盘;利用VZV WHO免疫球蛋白标准品对检测限参考品进行标定,通过不同厂家的协作标定最终确定国家参考品的质量标准,并对其稳定性和均匀性进行考察。结果参考品由8支阴性参考品、10支阳性参考品、1份重复性参考品和6支检测限参考品组成。质量标准为:阴性参考品符合率至少为7/8;阳性参考品符合率至少为9/10;检测限的浓度不高于127 mIU/ml;重复检测重复性参考品10次,其A值的变异系数不高于15.0%。该参考盘存放于不同条件下,相对稳定且均一性较好。结论成功建立了1套用于评价VZV IgG抗体检测试剂盒国家参考品。     

EV71抗原BA-ELISA检测方法的建立及应用

目的建立EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫(BA-ELISA)检测方法,并进行验证及初步应用。方法以抗EV71抗体为包被抗体,利用生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA法,并对其灵敏度、特异性、准确性及精密性进行验证。采用该方法检测组织培养及临床样品中EV71抗原的含量。结果所建立的BA-ELISA法在EV71蛋白含量625～156.25ng/ml之间线性关系最佳,R2达0.9976,灵敏度为78.125～156.25ng;与包括CoxA16在内的42种肠道病毒及相关病毒均无交叉反应;检测10份EV71阳性样品和10份阴性样品,结果符合率均为100%;检测EV71原液和高、中浓度样品的变异系数分别为3.09%、6.69%和6.43%;可检出约103～104CCID50的活病毒及手足口病患者的大便悬液和部分咽拭子悬液中的病毒。结论用生物素标记EV71抗体与亲和素系统建立的双抗体夹心ELISA法具有较高的特异性、灵敏度、准确性和精密性,为临床检验及抗原分析提供了参考。     

α-肿瘤坏死因子吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立及验证

目的建立检测ɑ-肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorɑ,TNF-ɑ)的吖啶酯化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)方法并进行验证。方法采用全自动化学发光分析仪,用吖啶酯标记TNF-ɑ多克隆抗体,生物素标记TNF-ɑ单克隆抗体,链霉亲和素包被磁颗粒,利用磁颗粒-链霉亲和素-生物素系统实现固相和液相的分离,建立检测TNF-ɑ的吖啶酯CLIA方法;验证方法的检测限、线性范围、准确性、精密度及特异性,用优化后的方法检测150份健康血清样本确定正常参考值范围。应用该方法与西门子immulite1000试剂盒平行测定75份TNF-ɑ血清样本。结果吖啶酯CLIA方法反应条件为加入50μL样本,用PBS-1%BSA稀释校准品,加入1∶2 000稀释生物素及吖啶酯标记抗体。该方法最低检测限为0. 245~0. 519 pg/mL,样本在5~1 000 pg/mL范围r均大于0. 990 0;TNF-ɑ质控品回收率为92. 6%~104. 9%,3种浓度质控品批内CV <5%,总CV <10%;对溶血、脂血、类风湿因子及常见肿瘤药等干扰率均小于10%;系统检测值可溯源至国际标准品。150份健康血清样本正常参考值范围确定为<10 pg/mL。该方法与西门子TNF-ɑ蛋白检测试剂盒相关系数r=0. 989 0;检测值之间差异呈现随机化,无系统误差。结论成功建立了优化检测TNF-ɑ的吖啶酯CLIA方法,该方法精密度高、线性范围广、特异性强、检测结果准确性好,适合临床推广使用。     

膜抗原荧光抗体法与ELISA法检测水痘-带状疱疹病毒血清抗体的比较

目的比较膜免疫荧光抗体法(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)与ELISA法检测水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)血清抗体的效果。方法以FAMA法为"金标准",同时用德国Serion定量ELISA试剂盒检测184份血清样本(水痘疫苗免前92份、免后92份)的VZV Ig G抗体滴度,并对两种方法的测定结果进行比较。结果 FAMA法检测的阳性率为64.7%,抗体几何平均滴度(GMT)为1∶6.34,ELISA法检测的阳性率为47.8%,平均抗体活性值为492.33 m IU/ml。ELISA法的特异性为100%,阳性符合率(灵敏度)为69.7%,阳性符合率随着抗体滴度的增加而升高(z=-6.03,P0.001)。Fisher精确概率法分析结果显示,抗体滴度1∶8、1∶16和1∶32组与≥1∶64组阳性符合率差异均有统计学意义(P0.05),其余各组间阳性符合率差异均无统计学意义(P0.05)。ELISA抗体活性值与抗体滴度呈明显正相关,相关系数R2=0.656,P0.001;Kappa值为0.707,两种方法具有较高的吻合度。结论德国Serion定量ELISA试剂盒在检测低抗体滴度VZV抗体时易出现假阴性,在检测高滴度VZV抗体时,两种方法敏感性相当;ELISA试剂盒检测的滴度临界值为1∶8~1∶32。该试剂盒可用于疫苗免疫效果评价和人群VZV抗体水平监测。     

大鼠血清中抗轮状病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及验证

目的建立大鼠血清中抗轮状病毒(rotavirus,RV)IgG抗体的间接ELISA检测方法,并进行验证。方法以兔抗RV多抗血清作为包被抗体,RV作为检测抗原,建立抗RV IgG抗体间接ELISA检测方法。棋盘滴定法优化包被抗体浓度(1∶1000~1∶1024000)和血清浓度(1∶20~1∶2560),直接ELISA法优化生物素标记的羊抗大鼠IgG工作浓度(1∶1000~1∶128000稀释)。采用优化的间接ELISA法检测39份RV抗体阴性大鼠血清样品,样品A450均值加上3倍标准差作为该检测条件的阴阳性判定界值。同时对该方法的专属性、检测限、耐用性进行验证。分别采用建立的方法及荧光灶形成单位(fluorescent focus-forming unit,FFU)方法检测96份临床前安全性评价试验样品,评价二者的符合率。结果建立的间接ELISA法的最适反应条件为:包被抗体稀释倍数为1∶8000,血清稀释倍数为1∶80,生物素标记的羊抗大鼠IgG工作浓度为1∶4000,阴阳性判定界值为0.105。方法检测限为0.031,且具有良好的专属性及耐用性。建立的方法与FFU方法检测结果的符合率达95.8%。结论成功建立了抗RV IgG抗体的间接ELISA检测方法,且方法准确可靠,为临床前安全性评价试验提供了一种简便的血清学诊断方法。     

以IU为单位的乙型肝炎病毒核心抗体国家参考品的建立

目的建立以IU为单位的乙型肝炎病毒核心抗体(hepatitis B core antibody,HBcAb)国家参考品。方法从我国多个省份血液中心和采浆站收集血清、血浆样品300份,应用5家国产和2家进口HBcAb诊断试剂初步筛选,并采用WHO国际HBcAb标准品进行标定,同时验证初步筛选获得的参考品的稳定性及适用性。结果建立了HBcAb国家参考品,包括阴性参考品15份、阳性参考品15份、灵敏度参考品1份、精密性参考品1份。其中灵敏度参考品经WHO国际HBcAb标准品标化后定量为5 IU/ml,19家发光试剂和酶联免疫试剂的最低检出限均值分别为0.67及0.53 IU/ml。参考品经4℃、常温、37℃保存及反复冻融后与置-20℃保存的参考品在阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、最低检出限及精密性等方面的结果均一致。5家国产试剂检测阴性参考品符合率均为15/15,阳性参考品符合率均为15/15,其中3家试剂的最低检测限高于1.0 IU/ml,精密性CV均20%。结论成功建立了以IU为单位的HBcAb国家参考品,且具有良好的稳定性及适用性,为提高HBcAb诊断试剂的质量奠定了基础。     

应用重组HBcAg与其单克隆抗体配对检测抗—HBc

抗—HBc单克隆抗体经纯化、酶标后，用作包被抗体和酶标抗体，重组工程菌表达的HBcAg作为联结抗原，选择最佳配对单克隆抗体，用ELISA法检测临床标本593份，其中与Abbott试剂盒对照检测91份，符合率达99．09％，与国内的ELISA试剂盒对照检测502份，符合率达98.1％，证明该单克隆抗体ELISA试剂盒检测抗—HBc的特异性、灵敏度、精确性均属国内领先水平。     

几家HCV抗体诊断试剂盒检测系列血清的比较

应用Abbott、UBI及国内几家的HCV第二代抗体诊断试剂盒A、B、c及D检测25名HCV感染者的210份感染后不同时期的系列血清,首次采用ELISA及RIBA分片段检测抗体,并与敏感的PCR法检测血清中HCV RNA结果相比较。虽然各试剂盒的总体检测符合率无显著性差异,但个别国产试剂盒的早期检测能力尚有待提高。用任何一家抗体检测试剂盒均会漏检小部分标本,抗体检测阴性的血清在100000倍稀释后仍可检出HCV RNA,因此,有必要发展包括更多片段包被的第三代HCV抗体诊断试剂盒。     

鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用纯化的鼠疫菌F1抗原作为包被抗原,HRP标记的F1抗原作为酶标抗原,建立鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、敏感性、特异性、准确性和稳定性验证。结果鼠疫菌F1抗原的最佳包被浓度为0.6μg/ml,HRP标记的F1抗原的最佳工作浓度为1︰7 000。制备的试剂盒检测精密性质控品的板内变异系数为6.5%,板间变异系数为7.1%;检测高、中、低浓度内部质控品和精密性质控品的回收率在95%¹12%之间;检测阳性血清和阴性血清的敏感性为100%;与正常人血清、正常兔血清、正常小鼠血清、兔抗假结核耶尔森菌血清、小鼠抗假结核耶尔森菌血清均无交叉反应;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,达到了体外诊断试剂的注册要求,可用于鼠疫的临床监测、诊断及预后判断。     

Computer-aided antibody design

Recent clinical trials using antibodies with low toxicity and high efficiency have raised expectations for the development of next-generation protein therapeutics. However, the process of obtaining therapeutic antibodies remains time consuming and empirical. This review summarizes recent progresses in the field of computer-aided antibody development mainly focusing on antibody modeling, which is divided essentially into two parts: (i) modeling the antigen-binding site, also called the complementarity determining regions (CDRs), and (ii) predicting the relative orientations of the variable heavy (V(H)) and light (V(L)) chains. Among the six CDR loops, the greatest challenge is predicting the conformation of CDR-H3, which is the most important in antigen recognition. Further computational methods could be used in drug development based on crystal structures or homology models, including antibody-antigen dockings and energy calculations with approximate potential functions. These methods should guide experimental studies to improve the affinities and physicochemical properties of antibodies. Finally, several successful examples of in silico structure-based antibody designs are reviewed. We also briefly review structure-based antigen or immunogen design, with application to rational vaccine development.     

牛对氧磷酶-1蛋白多克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的制备牛对氧磷酶-1(paraoxonase-1,PON-1)蛋白多克隆抗体,并建立PON-1的双抗夹心ELISA检测方法。方法将重组牛PON-1蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,经AKTA蛋白纯化系统纯化抗体。以获得的多克隆抗体为捕获抗体,牛PON-1单克隆抗体为检测抗体,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,构建牛PON-1蛋白的双抗夹心ELISA检测法,并对多克隆抗体(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800)及单克隆抗体浓度(0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、3. 2、6. 4 mg/mL)、包被条件(37℃孵育2 h、4℃孵育过夜)、封闭液(1%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、0. 5 mol/L氯化铵)、封闭条件(37℃2 h、37℃4 h、4℃过夜)进行优化,同时验证方法的线性及准确度。采用该方法及市售试剂盒同时检测酮病组及对照组奶牛血清中的PON-1含量。结果建立的双抗夹心ELISA法最适检测条件为:单克隆抗体浓度为3. 2 mg/mL,多克隆抗体工作浓度为1∶800稀释,封闭液为5%脱脂奶粉,包被及封闭条件均为4℃过夜。牛PON-1蛋白标准品浓度在90～3 125 ng/mL浓度范围内,与A_(450)值呈良好的线性关系,标准曲线方程为y=0. 618 6 x-0. 753 6,R~2=0. 981 3;5份样品检测结果均值为764. 21 ng/mL,回收率为97. 97%。市售试剂盒和本实验建立方法检测酮病组奶牛体内PON-1含量均显著低于对照组(P 0. 001)。结论成功获得了抗牛PON-1蛋白的多克隆抗体,并建立了牛PON-1蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,且该方法具有良好的线性及准确度。     

Computer-based engineering of thermostabilized antibody fragments

We used the molecular modeling program Rosetta to identify clusters of amino acid substitutions in antibody fragments (scFvs and scAbs) that improve global protein stability and resistance to thermal deactivation. Using this methodology, we increased the melting temperature (T_m) and resistance to heat treatment of an antibody fragment that binds to the Clostridium botulinum hemagglutinin protein (anti-HA33). Two designed antibody fragment variants with two amino acid replacement clusters, designed to stabilize local regions, were shown to have both higher T_m compared to the parental scFv and importantly to retain full antigen binding activity after 2 hr of incubation at 70°C. The crystal structure of one thermostabilized scFv variants was solved at 1.6 Å and shown to be in close agreement with the RosettaAntibody model prediction.     

Repertoires of aggregation-resistant human antibody domains

We recently described a method for the generation of a large human domain antibody repertoire involving combinatorial assembly of CDR building blocks from a smaller repertoire comprising a high frequency of aggregation-resistant antibody domains. Here we show that the frequency of aggregation-resistant domains in the combinatorial repertoire remained high. Furthermore, one of the antigen-binding domains selected from the combinatorial repertoire retained its binding properties through 25 cycles of thermal denaturation, suggesting that antibody domains can be created that rival the heat-resistance of thermophilic proteins such as Taq polymerase.     

Synthetic molecules as antibody replacements

Antibodies are by far the most versatile, valuable, and widely used protein-binding agents. They are essential tools in biological research and are increasingly being developed as therapeutic reagents. However, antibodies have a number of practical limitations, and it would be desirable in many applications to replace them with simpler, more robust synthetic molecules. Unfortunately, synthetic protein-binding agents rarely exhibit the high affinity and specificity typical of a good antibody. This article reviews efforts to overcome these limitations and to develop a facile, high-throughput methodology for the isolation of synthetic protein ligands with antibody-like binding characteristics.     

一种单克隆抗体的电荷异质体分析

目的对抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体的电荷异质体进行结构鉴别及生物学功能分析。方法通过检测抗PD-1单克隆抗体经专一性蛋白酶(唾液酸酶及羧肽酶)酶切前后的变化,初步确认电荷异质体的种类。采用阳离子交换色谱对电荷异质体进行分离和收集,经联用液相色谱-质谱(LC-MS)法分析电荷异质体各组分的组成;通过抑制抗原与配体相互作用影响NFAT荧光素酶报告基因表达的方法确定电荷异质体的生物学功能。结果碱性异质体含量较少,主要变化为重链N-末端谷氨酰胺未环化;酸性异质体主要变化为重链N383脱氨化和糖链末端唾液酸化。各异质体的生物学活性为89%~102%。结论抗PD-1单克隆抗体电荷异质体大部分修饰位点均远离互补决定区(complementary determining region,CDR),且在体外生物学活性方面差异较小。     

诺如病毒优势流行基因型间免疫交叉阻断谱分析

目的分析诺如病毒(norovirus,NoV)GⅠ和GⅡ基因群内5种优势流行基因型(GⅠ. 1、GⅡ. 2、GⅡ. 3、GⅡ. 4、GⅡ. 17)间的抗体交叉反应性和交叉阻断活性,为NoV疫苗的研发路线和疫苗临床研究设计提供基础数据。方法使用经铝佐剂吸附的NoV GⅠ. 1、GⅡ. 2、GⅡ. 3、GⅡ. 4、GⅡ. 17病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)和佐剂对照品免疫小鼠,抗原剂量为3μg/只,第28天加强免疫1次,第56天处死小鼠,采集血清,采用间接ELISA法检测小鼠血清中各型NoV特异性IgG抗体,以基于ELISA法的受体结合阻断试验检测各型NoV阻断抗体。结果 GⅠ. 1型和GⅡ基因群各型间交叉反应IgG抗体GMT均小于或接近cut-off值(滴度=40)。GⅡ各型间,GⅡ. 2和GⅡ. 3VLP免疫小鼠后,均可诱导针对其余型别的交叉反应IgG抗体,各组GMT在494～2 792之间。GⅡ. 4 VLP可诱导GⅡ. 2 IgG抗体(GMT=1 660),以及较低水平的GⅡ. 3(GMT=226)和GⅡ. 17(GMT=147)IgG抗体。GⅡ. 17 VLP可诱导GⅡ. 2(GMT=6 401)和GⅡ. 3(GMT=830)IgG抗体。GⅠ. 1型和GⅡ各型间交叉阻断抗体GMT均小于cut-off值(BT_(50)=20)。在GⅡ各型间,交叉阻断抗体阳性的分别为:GⅡ. 2 VLP免疫血清对于GⅡ. 3和GⅡ. 4,GⅡ. 3VLP免疫血清对于GⅡ. 2,GⅡ. 4和GⅡ. 17 VLP免疫血清对于GⅡ. 2和GⅡ. 3;上述阻断抗体GMT均在31～73之间,且各组间针对同一型别的交叉阻断抗体GMT差异无统计学意义。GⅡ. 2、GⅡ. 3和GⅡ. 4均无针对GⅡ. 17的交叉阻断活性。结论 NoV GⅠ基因群和GⅡ基因群间不存在抗体交叉反应性和交叉阻断活性,而GⅡ群部分型别间存在有限的抗体交叉反应性和交叉阻断活性。