L-瓜氨酸生产菌株的筛选及鉴定

通过选择性培养基初筛(利用精氨酸双水解酶筛选培养基)和复筛(高效液相色谱法测定L-瓜氨酸质量浓度),从杭州市勾庄地区西瓜大棚的土壤中筛选获得45株产L-瓜氨酸菌株.其中一株细菌(菌株编号11)转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸的能力最强,产生的L-瓜氨酸浓度最高,0.344 g湿菌,在60 mL转化体系中转化一天,可将20 g/L的底物L-精氨酸转化为9.31g/L的L-瓜氨酸.对11号菌株分别进行形态学观察,生理生化试验及分子生物学鉴定,初步鉴定该菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis).     

L-瓜氨酸的工程菌制备及在卷烟中的应用

利用工程菌中的精氨酸托亚氨基酶转化制备L-瓜氨酸,进行了培养基、诱导条件和细胞转化条件的研究。培养基最佳组成为:葡萄糖质量浓度5 g/L,胰蛋白胨20 g/L,K2HPO4.3H2O 1 g/L,MgSO4.7H2O 1 g/L;最佳诱导条件为:OD600值1.0,诱导温度25℃,诱导时间7 h,诱导剂(乳糖)5 g/L;最佳的细胞转化条件为:pH 6.0,温度40℃,精氨酸质量浓度60 g/L。在最佳条件下瓜氨酸的产量达55.1 g/L,细胞可连续使用三次,且产量稳定。在卷烟中的初步应用研究结果显示:当其用量为0.02%时综合效果最好。     

填充床反应器中固定化假单胞菌细胞连续制备L-瓜氨酸

对实验室筛选的产精氨酸脱亚胺酶的假单胞菌( Pseudomonas sp.)进行了固定化,以及对固定化细胞转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸进行了研究.比较4种不同固定化方法,确定卡拉胶包埋结合戊二醛后处理为假单胞菌的细胞固定化方法.固定化反应的最适pH值为6.5,细胞固定化后细胞精氨酸脱亚胺酶的热稳定性增加.在50 mm×240 mm固定填充床反应器中,底物浓度为0.5 mol/L L-精氨酸盐酸盐,pH值6.5,温度37 ℃,稀释速率为0.147/h的条件下,连续运转54 d,固定化细胞对底物的摩尔转化率在95%以上,平均生产强度 0.010 8 g/(h*g)(每单位质量的固定化细胞每小时生产的瓜氨酸质量).转化液经732阳离子树脂吸附,氨水洗脱,及浓缩、结晶,得到纯度为99%的L-瓜氨酸晶体,提取总收率约为87%.     

基于钝齿棒杆菌argGH启动子改造的L-瓜氨酸高效合成

L-瓜氨酸是尿素循环的重要中间体,在argGH编码酶的催化下易分解为L-精氨酸,在微生物体内难以大量积累。作者通过启动子替换手段,以弱启动子P-dapAB6替换调控argGH表达的启动子P-argG,构建了弱化L-瓜氨酸分解代谢途径的重组菌株Corynebacterium crenatum H-7-PdapAB6:argGH。重组菌株的转录水平和酶活力结果显示,重组菌株分解途径中argG和argH的基因表达水平下调,精胺琥珀酸合成酶ASS(argG编码)和精胺琥珀酸裂解酶ASL(argH编码)酶活分别降低91.80%和55.35%。摇瓶发酵结果表明,L-瓜氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度分别为33.85 g/L、0.25 g/g和0.34 g/(L·h),较原始菌株分别提高了4.91、5.00和4.86倍。通过启动子替换策略,构建了L-瓜氨酸分解代谢途径弱化的工程菌株,初步实现了L-瓜氨酸的高效合成。     

黄色短杆菌B．003产L-精氨酸发酵条件的研究

目的通过对摇瓶发酵条件的研究,提高黄色短杆菌B-003 L-精氨酸的产量。方法在单因素实验的基础上,利用响应面法,以L-精氨酸的产量为响应值,研究L-精氨酸摇瓶发酵条件。结果 Plackett-Burman设计筛选出3个对L-精氨酸产量有显著影响的因素：葡萄糖、硫酸铵和磷酸二氢钾的浓度,通过Box-Behnken试验设计得出,葡萄糖的浓度为99.57 g/L,硫酸铵浓度为60.80 g/L,磷酸二氢钾浓度为2.18 g/L时L-精氨酸产量最高。结论在最佳培养条件下,L-精氨酸产量达24.10 g/L,与最初培养条件相比产量提高了58.55%。     

反胶团萃取L-精氨酸的研究

通过5因素4水平的正交试验,研究反胶团体系中丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠(AOT)浓度、苯取pH值、萃取离子强度、反萃取pH值、反萃取离子强度5个因素对L-精氨酸提取的影响.结果表明:萃取pH值和反萃取pH值对L-精氨酸的反胶团萃取起着显著作用,各因素作用的主次顺序为萃取pH值>反萃取pH值>萃取离子强度>反萃取离子强度>AOT浓度,即萃取pH值对反胶团萃取L-精氨酸影响最大.正交试验得到的最优提取条件为萃取pH 7.0,反萃取pH 13.0,萃取离子强度0.2mol/L,反萃取离子强度1.5mol/L,AOT浓度60.0mmol/L,L-精氨酸的萃取率65%左右.     

黄色短杆菌B-003产L-精氨酸发酵条件的研究

目的通过对摇瓶发酵条件的研究，提高黄色短杆菌B-003 L-精氨酸的产量。方法在单因素实验的基础上，利用响应面法，以L-精氨酸的产量为响应值，研究L-精氨酸摇瓶发酵条件。结果 Plackett-Burman设计筛选出3个对L-精氨酸产量有显著影响的因素：葡萄糖、硫酸铵和磷酸二氢钾的浓度，通过Box-Behnken试验设计得出，葡萄糖的浓度为99.57 g/L，硫酸铵浓度为60.80 g/L，磷酸二氢钾浓度为2.18 g/L时L-精氨酸产量最高。结论在最佳培养条件下，L-精氨酸产量达24.10 g/L，与最初培养条件相比产量提高了58.55%。     

L-鸟氨酸的细胞转化制备及在卷烟中的应用

利用工程菌中的精氨酸酶转化制备L-鸟氨酸。分析了pH、温度、金属离子、底物浓度等因素对L-鸟氨酸产量的影响。试验结果得出最佳工艺为:pH 10,温度40℃,Mn2+添加量5 mmol/L及L-精氨酸浓度50 g/L,L-鸟氨酸的产量达35.1 g/L,在优化条件下细胞可连续使用4次,且产量稳定。在卷烟中的应用初步研究结果表明:当其用量为0.03%时综合效果最好。     

发酵液中L-精氨酸的检测方法

目的建立发酵液中L-精氨酸的定量检测方法。方法用坂口试剂(α-萘酚和2,3-丁二酮)定量测定L-精氨酸的含量。结果最佳测定波长为525nm,显色反应温度为30℃,反应时间为15min,NaOH浓度为15g/L。该方法具有较高稳定性和重复性。结论本方法可对发酵液中L-精氨酸进行定量测定。     

高效液相色谱-蒸发光散射测定瓜蒌中L-瓜氨酸的含量

建立了高效液相色谱-蒸发光散射测定瓜蒌中L-瓜氨酸含量的实验方法.色谱分离使用Agilent ZORBAX SB-Aq柱(250 mm×4.6mm i.d.,5μm),流动相为水,流速为1.0mL/min.柱后流出物采用蒸发光散射检测器检测,飘移管温度为115℃,空气做载气,流速为3.2L/min.L-瓜氨酸的峰面积的对数值与质量浓度的对数值呈良好的线性关系,线性范围为0.05 ～0.75 mg/mL,检出限为12.9μg/mL,加标回收率为98.36％,相对标准偏差为1.77％.将该法用于实际样品的测定,结果表明瓜蒌中L-瓜氨酸的含量为0.1 mg/g左右.该方法简单、快速、准确、重现性好,适用于瓜蒌药材中L-瓜氨酸的定量分析.