固定化脂肪酶性能研究及在洗毛中的应用

利用硅藻土吸附法对解酯假丝酵母发酵产生的脂肪酶进行了固定化,研究了固定化酶和游离酶的酶学性质,以及用固定化脂肪酶对羊毛进行生物酶法洗毛。结果表明:固定化酶比游离酶的最适作用温度提高了5℃,最适作用pH值向碱性方向移动了0.5个单位,热稳定性和pH值稳定性有了大幅度提高。在固定化酶的最适作用pH值下,得到最佳的洗毛条件为:温度45℃、浴比1∶35、时间20 h。     

脂肪酶的研究进展

随着生物技术的日新月异，酶固定化技术，界面酶学和非水酶学研究与应用的突破性进展，使得人们对微生物脂肪酶产生了极大的兴趣。论述脂肪酶的种类和高产菌珠以及脂肪酶的一些性质和应用。     

定点突变提高碱性果胶酶热稳定性

碱性果胶酶(PGL,E.C.4.2.2.2)是一种重要的工业酶,在碱性条件下催化聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。为提高酶热稳定性,将Bacillus sp.WSHB04-02 PGL与3种耐热酶进行氨基酸序列比对,确定7个在耐热酶中保守但在PGL中不保守的位点(158、N189、G191、S229、K314、S315和I325)作为改造的目标位点,单独突变为耐热酶中的保守氨基酸。酶学性质分析显示,PGL突变体热稳定性均有提高。与野生酶相比,N189E、S229K和I325F的55℃半衰期分别提高2.32倍、2.11倍和1.89倍;I58V和K314M 55℃半衰期分别提高19.4%和38.9%,比酶活分别提高65%和91%。结构分析显示,除S315G外的PGL突变体的分子内的多种作用力数量均发生改变。上述结果表明,定点突变能有效提高PGL热稳定性,分子间作用力的变化可能是酶学性质变化的重要原因之一。     

黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶新基因lipB的克隆和表达

目的克隆黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶基因lipB于大肠杆菌中表达后研究其酶学性质。方法 PCR克隆脂肪酶基因,与质粒pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)。硫酸铵沉淀法纯化表达产物,研究酶的稳定性等酶学性质。结果成功克隆了S.marcescens ECU1010中脂肪酶基因lipB(GenBank:HM440338),在E.coli中高效表达。LipB最适反应温度40℃,最适pH 8.5。该酶能在pH 5~7条件下保持稳定,Ca2+有促进酶活性的作用。LipB对不同有机溶剂的耐受性与黏质沙雷菌脂肪酶LipA有明显差异。结论 lipB基因克隆丰富了脂肪酶基因资源,分析LipB的酶学性质表明,此酶在食品工业和手性药物的拆分等领域有广阔的应用前景。     

定向引入N-糖基化位点促进芳基醇氧化酶热稳定性及底物亲和力

芳基醇氧化酶在木质素降解过程中发挥重要作用,N-糖基化修饰影响其酶学性质。该文旨在通过研究刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）来源的芳基醇氧化酶N-糖基化,来提高其热稳定性和底物亲和力。利用毕赤酵母GS115表达系统和定点突变技术,构建表达6种芳基醇氧化酶突变体蛋白,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和热稳定性分析。结果表明,芳基醇氧化酶N89和N249糖基化位点突变导致最适温度和70℃时酶热稳定性降低;在这个过程中,将其引入新的糖基化位点后的突变体,其最适酸碱度没有变化,最适温度以及70℃下的热稳定程度都明显优于野生型;以藜芦醇为底物时,突变体[AAO(F-X-N-X-T)]与底物亲和力最高。N-糖基化主要影响芳醇氧化酶的热稳定性,其中N89和N249位点的N-糖基化对酶的热稳定性起重要作用;引入N-糖基化位点[AAO(F-X-N-X-T)]能获得具有高活力和高稳定性的芳醇氧化酶。     

黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶新基因lipB的克隆和表达

目的 克隆黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶基因lipB于大肠杆菌中表达后研究其酶学性质.方法 PCR克隆脂肪酶基因,与质粒pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3).硫酸铵沉淀法纯化表达产物,研究酶的稳定性等酶学性质.结果 成功克隆了S.marcescens ECU1010中脂肪酶基因lipB(GenBank:HM440338),在E.coli中高效表达.LipB最适反应温度40℃,最适pH8.5.该酶能在pH5～7条件下保持稳定,Ca<'2+>有促进酶活性的作用.LipB对不同有机溶剂的耐受性与黏质沙雷菌脂肪酶LipA有明显差异.结论 lipB基因克隆丰富了脂肪酶基因资源,分析LipB的酶学性质表明,此酶在食品工业和手性药物的拆分等领域有广阔的应用前景.     

碱性脂肪酶产生菌扩张青霉变株(Penicillium expansumn)特性及其酶学特性的研究

研究了扩展青霉碱性脂肪酶高产菌株W-1520与W-1633的菌株特性及二者所产脂肪酶的纯化、酶学性质的研究,得出以下结果:扩展青霉W-1633的孢子生长速度、斜面生长速度与摇瓶生长速度均比W-1520快.菌株同工酶电泳的结果表明:W-1633酯酶同工酶带数比W-1520的多.对两种脂肪酶酶学性质也做了初步研究.     

碱性脂肪酶产生菌扩张青霉变株（Penicillium expansum）特性及其酶学特性的研究

研究了扩展青霉碱性脂肪酶高产菌株W－1520与W－1633的菌株特性及二者所产脂肪酶的纯化、酶学性质的研究，得出以下结果：扩展青霉W－1633的孢子生长速度、斜面生长速度与摇瓶生长速度均比W－1520快。菌株同工酶电泳的结果表明：W－1633酯酶同工酶带数比W－1520的多。对两种脂肪酶酶学性质也做了初步研究。     

不同来源脂肪酶的催化反应性质比较

研究了三种脂肪酶的催化反应性质,包括水解作用pH、温度适宜范围,酶的酸碱稳定性和热稳定性,酶催化水解作用的底物脂肪酸特异性和酯键位置特异性,及对逆向反应的催化作用等。对三种酶的催化反应的机制进行了比较和讨论。     

麦芽中脂肪酶活性检测及酶学性质的研究

以乙酸对硝基苯酚酯(p-NPA)为底物,采用对硝基苯酚法测定了麦芽中脂肪酶的活性,并对其酶学性质进行了研究.实验结果表明,麦芽中脂肪酶的最适反应pH为8.5,与5mmol/L的p-NPA的最适反应体积比为1∶7,金属离子Mg2+对麦芽脂肪酶活性有显著的抑制作用,Fe3+、K+则有一定激活作用;该酶热稳定性较强,40℃水浴保温120min,其酶活性几乎保持不变,70℃保温120min后接近失活.麦芽脂肪酶对p-NPA的酶动力学常数Km为0.13mmol/L,Vm值为0.016mg/min.     

Amino acid residues contributing to stabilization of Fusarium heterosporum lipase

Fusarium heterosporum lipase is composed of an N-terminal large peptide of 275 amino acids and a C-terminal peptide of 26 amino acids. The thermostability of the lipase was remarkably decreased by cleavage of the C-terminal peptide. Hence, we attempted to specify the amino acids in the C-terminal peptide that are responsible for the stabilization of the lipase. Replacement of Asp293 with Ala, Asn, and Lys caused a significant decrease in thermostability, but its mutation to Glu did not decrease the stability significantly. These findings showed that the lipase with the C-terminal peptide was stabilized by an ionic bond between the negative charge of Asp293 and positive charge of an amino acid of the N-terminal large peptide. The thermostability of the lipase gradually decreased with increasing deletion size from the C-terminus, and a 13-amino acid deletion decreased the stability to the level of the lipase not having the C-terminal peptide. These results suggested that the 13-amino acid region from the C-terminus participated in the lipase stability. In addition, the lipase production correlated well with the lipase stability, showing that the C-terminal peptide also influenced the lipase productivity.     

D-山梨糖对酶精练中脂肪酶热稳定性的影响

考察了脂肪酶的热稳定性,以及不同糖类添加剂对其稳定性的影响。结果表明,D-山梨糖能延长脂肪酶的半衰期,且添加D-山梨糖后,脂肪酶的失活自由能也得到了提高。采用脂肪酶精练棉织物时,添加0.5%D-山梨糖,精练效果更好。     

Lyophilization of lipase with cyclodextrins for efficient catalysis in ionic liquids

Lipase was lyophilized with cyclodextrins to prepare lipase formulation suitable for the efficient resolution of allethrolone in ionic liquids. The effects of the type and amount of cyclodextrin used on lipase preparation were evaluated, and the properties of lyophilized lipase such as thermostability and pH sensitivity were investigated and compared with those of native lipase. The results showed that lipase lyophilized with cyclodextrins can achieve a higher conversion rate than the native one, and that lipase lyophilized with inorganic salts cannot improve the conversion rate of the resolution reaction. The catalytic behavior of the lyophilized lipase was strongly dependent on cyclodextrin type and reaction media. The activity of the lyophilized lipase increased as the amount of added cyclodextrins increased. The activity of the lipase lyophilized with cyclodextrins was optimum at pH 7 and 40 degrees C, which was similar to that of the native one, but the half-life of the lyophilized lipase was low compared with that of the native one.     

易错PCR技术改造扩展青霉脂肪酶

利用易错PCR技术,建立脂肪酶基因随机突变文库,将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母GS115,初步筛选了4000株突变菌株,对300株较优突变株进行酶的活力、耐热性、耐酸性的摇管复筛,进一步摇瓶复筛后获得优良突变株ep3,所产突变脂肪酶(ep3-GS)的适宜pH为9.4,适宜作用温度为35℃,与野生重组脂肪酶(PEL-GS)一致,该温度下酶的比活为3440 U/mg,比野生型脂肪酶提高17%。     

A154C/G155C双点突变对嗜热耐酸淀粉酶酶活性及热稳定性的影响

利用重叠延伸法对嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶基因BD5088进行体外A154C/G155C双点定点突变,通过原核表达载体pET30a构建表达载体pET-BD5088C2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,酶学性质分析表明,突变淀粉酶拓宽了反应pH值范围,尤其是酸性条件下提高更为显著。BD5088淀粉酶在100℃条件下酶活力半衰期约为22min,而突变酶酶活力半衰期40min,突变酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加热60min时,突变酶酶活力仍可维持原活力的40%,而BD5088淀粉酶只能维持20%左右。说明其热稳定性得到有效的提高。另外,突变酶在中温和90℃条件下酶活力有所提高,65℃时酶活力提高将近1倍。结果表明,BD5088淀粉酶的154、155位残基的突变为Cys对维持其热稳定性起到重要的作用,并且对其酶学性质有较大的影响,可能参与了二硫键的形成。     

偏甘油酯脂肪酶的研究进展及应用现状

相较于甘油三酯脂肪酶,偏甘油酯脂肪酶因其独特的底物选择性和催化高效性,逐渐成为相关领域的研究热点。旨在为偏甘油酯脂肪酶在油脂加工、脂质分子的定向合成等领域的研究提供理论和技术参考,并为挖掘新型的偏甘油酯脂肪酶打下基础,首先对偏甘油酯脂肪酶的来源和分类进行介绍,随后阐述了偏甘油酯脂肪酶的结构特征和催化特性,最后对其应用现状进行了总结归纳和展望。偏甘油酯脂肪酶有动物来源、植物来源和微生物来源,分为甘油单酯脂肪酶和甘油单酯-甘油二酯脂肪酶;偏甘油酯脂肪酶有帽区、催化三联体和氧负离子洞穴等结构,具有底物特异性和位置特异性;偏甘油酯脂肪酶在食品、有机合成、医疗等领域有着广泛的应用和独特的发展潜力。     

产低温脂肪酶菌株的筛选、纯化及其部分酶学性质研究

从大黑山(大连)和海水中筛出59株低温细菌,从中筛选出10株产低温脂肪酶的菌株,分别对其进行紫外诱变,筛出一株高酶活的低温脂肪酶菌株。通过形态学、生理生化和分子生物学鉴定,菌株CZWOO1属于芽孢杆菌属(BacillusCohn),与Bacillusthuringien-si(sNR 043403.1)进化关系近,且同源性达到100%,故将其命名为Bacillus thuringiensis CZWOO1。苏云金芽孢杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析获得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其分子量约40ku。对纯化后的低温脂肪酶进行二级结构预测,结果表明其二级结构成分:α-螺旋10.6%,β-折叠40.1%,β-转角18.8%,无规则卷曲30.5%。对该菌脂肪酶的酶学性质初步研究表明,酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30min仅残留30%酶活性,酶的适宜作用pH范围在7~9,最适pH值为8。     

α-亚麻酸特异性脂肪酶产生菌的筛选和诱变初探

从含油的泥土中采集60份样品，通过平板检测法进行初筛，摇瓶复筛，并测定酶活。复筛菌接种于平板，由菌落直径和其水解圈直径的比筛选出诱变出发菌株，用紫外光诱变方法对菌株进行诱变，由此分离出了埘富含α-亚麻酸的紫苏油具有一定专一水解能力的菌株，通过紫外诱变，其酶活较野生菌株增加了52.3％。     

Enhanced thermostability of alpha-chymotrypsin enclosed in inorganic microcapsules

Alpha-chymotrypsin was immobilized in inorganic microcapsules made of calcium silicate. In order to evaluate the performance of immobilized alpha-chymotrypsin, the rate of hydrolysis of N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester (ATEE) and the thermostability of alpha-chymotrypsin were examined. The hydrolysis of ATEE by both free and encapsulated alpha-chymotrypsins apparently obeyed Michaelis-Menten kinetics. The apparent Michaelis constant in the encapsulated system nearly equaled that in the free enzyme system. The extent of decrease in maximum velocity by encapsulating alpha-chymotrypsin was much smaller than that by encapsulating lipase, suggesting that the hydrophilicity of the substrate is a key factor in the diffusion process through the wall due to the hydrophilic surface of the microcapsules. The thermostability of alpha-chymotrypsin was considerably enhanced by the microencapsulation. The half-life of encapsulated alpha-chymotrypsin was 23 times as long as that of the free one.     

基于纳米金光学性质检测脂肪酶活性的研究进展

脂肪酶是食品工业广泛应用的酶制剂, 其活性大小对食品品质有重要影响, 因此对其活力测定成为食品检测中不可或缺的一部分。脂肪酶常见的测定方法有滴定法、皂铜比色法、平板法等, 但这些方法往往存在操作复杂、灵敏度不足、测量误差较大的缺点, 而基于纳米金光学性质检测脂肪酶具有简单快速、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点, 是一种良好的测定方法。本文主要从纳米金的光学性质和测定的原理、基于纳米金的光学特性检测脂肪酶的方法及未来发展3个方面对纳米金在测定脂肪酶活性方面的研究进展进行评述。目前, 使用纳米金检测脂肪酶活性仍然存在很多问题, 通过总结近年来脂肪酶活性的检测方法, 希望能对未来脂肪酶活性快速、灵敏检测起到一定的推进作用。