乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

奶粉中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的测定能力验证结果分析

目的 提高实验室用传统生化方法检测沙门氏菌和克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力和水平。方法 用空白添加法和交叉试验检查培养基性能后,以奶粉样品为材料,用传统生化培养方法进行检测。结果 发现在传统生化检测技术中,对于排除非沙门氏菌来说,BS板作用突出,XLD和沙门氏菌显色平板容易受干扰菌影响。W样品检出沙门氏菌,Q样品未检出沙门氏菌;V样品检出阪崎肠杆菌,G样品未检出阪崎肠杆菌。结论 通过该研究,本实验室的沙门氏菌和克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的传统生化检测技术水平和能力得到了提高。     

乳粉中克罗诺杆菌属阪崎肠杆菌能力验证样品制备及应用

目的 制备均匀性及稳定性均满足要求的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,用于组织能力验证考核。方法 通过生化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定背景菌株及所使用的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)菌株。采用冷冻干燥技术制备均匀性及稳定性均满足要求且各种菌含量为10⁴ CFU/瓶的能力验证菌球。依据CNAS-GL003∶2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,再将样品存放于-20 ℃、4 ℃进行保藏稳定性检验,存放于25 ℃、37 ℃进行运输稳定性检验。依据GB 4789.40—2016制定作业指导书并发放样品,回收各实验室结果进行统计。结果 目的菌株及背景菌株的鉴定结果均正确,均匀性、运输稳定性及保藏稳定性检验均符合能力验证样品的要求。依据评价原则及25家实验室反馈的结果,2021年度考核结果满意率为100%。结论 乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品满足本年度能力验证的要求,为参加考核的检测机构提供了外部质控考核结果。     

2018-2020年度乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品的研制及其应用

目的 制备乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,并应用于2018-2020年度实验室能力验证考核.方法 将背景菌株和克罗诺杆菌属通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定确认菌株种属.采用冷冻干燥技术制备的阴性样品(含背景菌)和阳性样品(含背景菌和克罗诺杆菌属).随机抽取阳性样品和阴性样品各2 0份进行...     

阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。     

生鲜蔬菜中阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定

从上海市售蔬菜中共采集样品102份,按照国标方法GB 4789.40—2010进行阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定。采用生化实验、PCR检测方法、BAX System Q7全自动病原微生物检测仪、API 20E试剂条鉴定和16S rDNA序列的测定对分离到的可疑菌株进行鉴定与确证。根据国标法的鉴定结果,102份样品中共有18份样品分离到可疑阪崎克罗诺杆菌菌株,进一步结合其他4种鉴定方法确定13份样品中分离到的可疑菌株为阪崎克罗诺杆菌菌株,分离率达13%(13/102)。通过研究说明生鲜蔬菜也是阪崎克罗诺杆菌比较常见的宿主或者污染源之一。     

某实验室参加食品检验用克罗诺杆菌属标准（样）品协作标定结果与分析

为对食品检验用克罗诺杆菌属标准(样)品克罗诺杆菌属菌的含量水平进行考察,锻炼和提高实验室对克罗诺杆菌属的检验能力,实验室按作业指导书要求进行样品的前处理及培养,计数参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落计数检验》,对10份编号分别为CODE 1至CODE 10的球状西林瓶装样品使用TSA琼脂平板进行计数,并从每件样品的TSA琼脂平板上挑取1个菌落进行生化鉴定。通过此次协作标定,标准(样)品克罗诺杆菌属含量在10~3 CFU/球水平,该实验室检测能力得到了有效锻炼和提高。     

阪崎肠杆菌3种检测方法的应用与分析

分别采用美国FDA、ISO/TS 22964-2006和GB4789-2010阪崎肠杆菌检测方法,同时采用缓冲液蛋白胨水(BPW)作为前增菌液,对FAPAS(Food Analysis Performance Assessment Scheme)提供婴幼儿配方奶粉进行阪崎肠杆菌定性检测,同时应用VITEK2生化鉴定和16SrDNA序列分析技术对分离的可疑菌落进行确认。结果表明:mLST-Vm选择性增菌肉汤和DFI显色平板可以提高工作效率和阳性检出率,可疑菌落易于识别,VITEK2(全自动微生物生化鉴定系统)和16SrDNA测序技术应用可以实现阪崎肠杆菌高效、快捷的检测。     

LAMP法在阪崎肠杆菌快速检测中的应用

针对阪崎肠杆菌的ompA基因设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立一种快速检测阪崎肠杆菌的DNA环介导恒温扩增法(LAMP)。通过对2株阪崎肠杆菌标准菌株、24株阪崎肠杆菌分离株和18株非阪崎肠杆菌测试,结果表明此方法具有很高的特异性;对其灵敏度进行检验,发现该方法的最低检测限可以达到8CFU/mL,具有较好的敏感性。在1份实验室能力验证盲样和26份实际奶粉样品中应用发现,该方法与传统生化方法结果吻合,具有较好的可靠性。     

巧克力中沙门氏菌能力验证结果与分析

目的 分析实验室对巧克力中沙门氏菌检测能力验证实验与结果。方法 依据GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对巧克力样品进行沙门氏菌检测。参照能力验证计划参试指导书来进行测定和结果判断。结果 通过平板法结合生化鉴定实验结果可知, 编号CODE:384有可疑目标菌落检出沙门氏菌阳性菌, CODE:544、CODE:699的可疑目标菌落均未检出沙门氏菌阳性菌。结论 本次实验室对巧克力中沙门氏菌检测能力验证结果合格, 为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染状况及致病性阪崎克罗诺杆菌生物膜形成能力研究

目的 克罗诺杆菌是重要的常见食源性致病菌,了解我国粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染情况及致病性,为食品中该菌的防控提供理论依据。方法 本研究对黑龙江、北京、河北等八个省份的226份食品样品的克罗诺杆菌污染情况进行检测分离,对分离菌株基于重组和修复蛋白(recombination and repair protein gene, recN)基因序列进行种间鉴定,并针对阪崎克罗诺杆菌应用脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)进行分子分型以及对生物膜形成能力进行研究。结果 所有样品中克罗诺杆菌的检出率为18.58%,其中146份粮食加工品中32份检出克罗诺杆菌(检出率21.2%),80份肉制品中有10份检出克罗诺杆菌(检出率12.5%)。种间鉴定显示,94株为阪崎克罗诺杆菌,6株为丙二酸盐克罗诺杆菌,3株为都柏林克罗诺杆菌,3株为尤尼沃斯克罗诺杆菌,9株为苏黎世克罗诺杆菌。PFGE分型结果表明,94株阪崎克罗诺杆菌可被分为49个型别。结晶紫染色实验结果表明所有阪崎克罗诺杆菌均在36 h~60 h时间范围内达到最大菌膜生产量。结论 上述八个省份粮食加工品和肉制品中存在克罗诺杆菌的污染,其中阪崎克罗诺杆菌有多种PFGE带型,且均具有生物膜形成能力,为食品安全风险评估及标准制定提供基础数据,对公众卫生和健康具有重要意义。     

克罗诺杆菌属食品分离株种水平鉴定方法比较研究

目的研究食品中分离克罗诺杆菌属种的鉴定方法,旨在建立稳定、可靠的种的鉴定方法。方法本研究选择三种鉴定方法,包括生化鉴定(VITEK 2 Compact)法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、全基因组测序,通过比较分析三种方法对19株克罗诺杆菌属的鉴定结果,阐述三种鉴定方法的优缺点及其适用性。结果本研究中19株克罗诺杆菌属的鉴定结果显示,VITEK 2 Compact对阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌的鉴定准确率只有67%和66%,而MALDI-TOF MS和全基因组测序的鉴定结果一致,因此可以判定MALDI-TOF MS能够快速、准确、高通量对克罗诺杆菌属进行种的鉴定。但是MALDI-TOF MS受限于数据库,不能鉴定到亚种的水平。结论本研究结果提示VITEK 2 Compact法不适用于克罗诺杆菌属种的鉴定;全基因组测序鉴定结果准确可靠;MALDI-TOF MS可以实现快速、高通量、准确的鉴定,仍需要进一步研究克罗诺杆菌属3个亚种的蛋白指纹图谱特点,丰富蛋白指纹图谱数据库,使其能够准确鉴定克罗诺杆菌属的7个种和3个亚种。     

运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌

目的运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌,以提高检验准确度。方法采用传统的增菌、选择性培养、生化鉴定方法进行样品检验,实时荧光PCR法作为辅助手段对BPW增菌液及可疑菌落进行扩增,最后用API20E鉴定系统对可疑菌落进行确认。结果 3个样品经增菌、选择性培养、生化鉴定后均无显著符合沙门氏菌菌落特征及生化特征的可疑菌落;缓冲蛋白胨水增菌液实时荧光PCR法扩增结果表明样品S02为可疑样品,其分离得到的菌落S02-4有典型扩增曲线;经API20E鉴定系统确认,样品S02为阳性样品,阳性菌为猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种。结论实时荧光PCR法操作简单,准确度高,可作为传统检验方法的有效补充。     

A simple and rapid cultural method for detection of Enterobacter sakazakii in environmental samples

A method was developed to detect and identify Enterobacter sakazakii in environmental samples. The method is based on selective enrichment at 45+/-0.5 degrees C in lauryl sulfate tryptose broth supplemented with 0.5 M NaCl and 10 mg/liter vancomycin (mLST) for 22 to 24 h followed by streaking on tryptone soy agar with bile salts. When exposed to light during incubation at 37 degrees C, E. sakazakii produces yellow colonies within 24 h; identification was confirmed by testing for alpha-glucosidase activity and by using API 20E strips. All of the E. sakazakii strains tested (n = 99) were able to grow in mLST at 45+/-0.5 degrees C, whereas 35 of 39 strains of potential competitors, all belonging to the Enterobacteriaceae, were suppressed. A survey was carried out with 192 environmental samples from four different milk powder factories. Using this new protocol, E. sakazakii was isolated from almost 40% of the samples, whereas the reference procedure (enrichment in buffered peptone water, isolation on violet red bile glucose agar, and biochemical identification of randomly chosen colonies) only yielded 26% positive results. This selective method can be very useful for the rapid and reliable detection of E. sakazakii in environmental samples.     

学生宿舍和食堂环境中克罗诺杆菌污染状况及分子分型和耐药特征分析

目的 了解徐州市某学校学生宿舍和食堂环境中克罗诺杆菌污染状况、分子分型及耐药特征,为预警食源性克罗诺杆菌病暴发提供参考.方法 采集徐州市某学校学生宿舍和食堂环境样品156份,分离并鉴定克罗诺杆菌,并利用基于O-抗原的血清分型和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对分离株进...     

广西市售婴儿食品中克罗诺菌分离株基因特征及进化分类鉴定

目的分析广西市售婴儿食品中的克罗诺菌分离株的种类、表型和基因特性。方法将保存的试验菌株进行复苏,通过API 20E生化条和omp A基因扩增检测进行初步鉴定,扩增16S r RNA基因后进行测序,将获得的全16S r RNA基因序列在Gene Bank数据库上比对,构建进化树,确认是否为克罗诺菌。将试验菌接种于显色平板观察其表型和黄色素的产生情况,通过手工生化进行分型,确定其种属。结果 9株分离菌确定为克罗诺菌,有5种生化型,属于4个克罗诺种。检出Cronobacter sakazakii 6株菌,C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis各有1株;7株菌符合API 20E鉴定结果,9株分离菌均可检测到omp A基因。结论广西市售婴儿食品中克罗诺菌的污染以C.sakazakii为主,生化表型、种属及基因型具有多样性;鉴定时仅以单一的生化或其他表型作为判别依据存在很大的局限,需辅以分子生物学手段加以鉴别。     

3种方法检测食品中致泻大肠埃希氏菌检测能力验证结果分析

目的提高食品中致泻大肠埃希氏菌的检测能力,促进实验室检测能力的提高。方法参照GB4789.6-2016《食品微生物学致泻大肠埃希氏菌检验》方法进行检测,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统进行生化鉴定、血清学鉴定,对可疑菌落进行普通PCR确证试验。同时使用多重实时荧光PCR法以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析鉴定可疑菌落。结果国标法和多重实时荧光PCR法能准确鉴定出目标菌,MALDI-TOF-MS可以检测大肠埃希氏菌,但无法区分致泻大肠埃希氏菌和肠出血性大肠埃希氏菌。结论 3种方法各有优劣,同时使用,综合判断,能确保试验结果准确快速。