6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系的建

目的 构建食源性致泻大肠埃希氏菌高效、快速、特异性强的检验方法。方法 根据6类致泻大肠埃希菌11种毒力基因引物, 采用煮沸法制备细菌基因组DNA作为模板构建致泻大肠埃希氏菌单菌多重PCR检测体系; 采用试剂盒法制备细菌基因组DNA作为模板构建6类菌十重PCR检测体系, 对2种检测体系进行优化并对其进行特异性、重复性验证。结果 构建了6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系, 包括单菌多重PCR、6类菌十重PCR检测体系。仅6类致泻大肠埃希氏菌阳性菌株有特异性条带产生; 不同类型致泻大肠埃希氏菌菌株均检出其特异性阳性条带, 该多重PCR检测方法重复性好, 稳定性强。结论 该方法可高效快速地确定待测样是否为大肠埃希氏菌及其致病型, 为食品中致泻大肠埃希氏菌的监控、预警及爆发引起食物中毒后溯源等提供参考。     

6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系的建立

目的构建食源性致泻大肠埃希氏菌高效、快速、特异性强的检验方法。方法根据6类致泻大肠埃希菌11种毒力基因引物,采用煮沸法制备细菌基因组DNA作为模板构建致泻大肠埃希氏菌单菌多重PCR检测体系;采用试剂盒法制备细菌基因组DNA作为模板构建6类菌十重PCR检测体系,对2种检测体系进行优化并对其进行特异性、重复性验证。结果构建了6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系,包括单菌多重PCR、6类菌十重PCR检测体系。仅6类致泻大肠埃希氏菌阳性菌株有特异性条带产生;不同类型致泻大肠埃希氏菌菌株均检出其特异性阳性条带,该多重PCR检测方法重复性好,稳定性强。结论该方法可高效快速地确定待测样是否为大肠埃希氏菌及其致病型,为食品中致泻大肠埃希氏菌的监控、预警及爆发引起食物中毒后溯源等提供参考。     

基于特征基因的不同类型致泻大肠埃希氏菌的分子鉴定

致泻大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的常见病原菌。将传统微生物学方法和分子鉴定方法相结合鉴定致泻大肠埃希氏菌。根据聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和测序建立5种不同类型致泻大肠埃希氏菌的分子鉴定标准,并对试验过程进行安全性评价,最后通过检测鲜肉中肠道集聚性大肠埃希氏菌验证此方法的适用性。结果显示5种致泻大肠埃希氏菌标准菌株的特征基因都有明显的条带,且与该特征基因的产物条带大小一致。同时,胶回收测序的结果与特征基因的序列一致性为100%,可利用PCR和测序鉴定5种致泻大肠埃希氏菌;在安全性评价试验中,利用细菌裂解液进行涂板,培养后均未发现菌落生成,因此没有生物安全隐患;肉样中的检测结果显示,有astA基因的目的条带,且测序结果与此基因序列一致,说明此方法能够准确鉴定出鲜肉中肠道集聚性大肠埃希氏菌。成功建立5种不同类型大肠埃希氏菌的分子鉴定方法,评价试验过程的安全性,并准确鉴定出肉样中的肠道集聚性大肠埃希氏菌,为实验室相关标准的制定和修订提供理论依据和有益借鉴。     

5 类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立

目的：建立快速检测和鉴别5?类致泻大肠埃希氏菌的多重实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法。方法：根据5?类致泻大肠埃希氏菌的11?组毒力基因eae、stx1、stx2、ipaH、uidA、estla、estlb、aggR、pic、elt、astA建立多重实时荧光PCR方法,该方法包括A、B?2?个反应体系,可分别检测肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒大肠埃希氏菌、肠聚集性大肠埃希氏菌,优化反应体系的引物、探针浓度以及PCR反应条件,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。结果：11?组基因的探针和引物均可特异性地扩增相应的基因片段,A体系检测下限可达到2.6×104?copies/反应,B体系检测下限可到达2.2×104?copies/反应。结论：本研究所建立的多重实时荧光PCR方法可以对同一样本同时采用A、B?2?个反应体系进行检测,不但可以确定待测样本是否为大肠埃希氏菌,而且还能判定其致病型别。为大肠埃希氏菌的临床检测、疾病预防以及爆发溯源等提供参考。     

2016年江苏省食源性疾病患儿中致泻大肠埃希氏菌毒力基因分布与耐药性特征

目的 了解江苏省食源性疾病患儿中致泻大肠埃希氏菌的流行状况、不同毒力基因型的分布和对抗生素的敏感性特征。方法 从江苏省各设区市的三甲医院共收集3566例食源性疾病患儿的粪便或肛拭子标本进行致泻大肠埃希氏菌检测, 用实时荧光定量PCR进行毒力分型, 用微量肉汤稀释法进行药敏实验。结果 江苏省食源性疾病患儿中, 共检出致泻大肠埃希氏菌104株, 总检出率为2.9%(104/3566)。在5种毒力基因型致泻大肠埃希氏菌中, 肠聚集性大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌是主要的毒力基因型, 分别占61.5%(64/104)、26.9%(28/104)。致泻大肠埃希氏菌对氨苄西林耐药率最高, 达71.2%, 其次为四环素和萘啶酸, 分别为59.6%和54.8%。未发现亚胺培南耐药菌株。多重耐药率为75.0%。结论 肠聚集性大肠埃希氏菌是导致江苏省儿童食源性疾病最主要的致泻大肠埃希氏菌。约95%以上的致泻大肠埃希氏菌对头孢他啶、头孢西丁敏感, 100%对亚胺培南敏感。耐药率及多重耐药率高, 应加强致泻大肠埃希氏菌耐药性监测及临床抗生素合理使用。     

密云区致泻大肠埃希菌耐药性及耐药基因研究

目的建立密云地区腹泻患者致泻大肠埃希氏菌的毒力基因及耐药基因数据库。方法采集腹泻患者粪便样本,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法鉴定致泻大肠埃希氏菌并确定毒力基因,采用微量肉汤稀释法确定耐药性,采用普通PCR方法对耐药基因进行检测。结果 2112份粪便样本中检出致泻大肠埃希氏菌114株,肠聚集性大肠埃希氏菌(enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)占57.9%,毒力基因以astA+pic、eae为主,萘啶酸(nalidixic acid, NAL)、氨苄西林(ampicillin, AMP)、四环素(tetracycline, TET)、磺胺异恶唑(sulfamethoxazole, SUL)耐药率均超过30%, 41株菌株多重耐药,主要流行的耐药因子为GyrA、GyrB、blaTEM、ParC、aadA1、tetA、tetB、SUL2、floR、aac(3′)-IIa。结论密云地区腹泻患者致泻大肠埃希氏菌多重耐药性及耐药基因的存在情况较为普遍,应开展长期的主动监测。     

北京市大兴区2018—2020年腹泻病人致泻大肠埃希氏菌检测结果分析

目的 了解北京市大兴区食源性疾病病例中致泻大肠埃希氏菌的感染情况、流行病学和病原学特征及耐药状况,为疾病防控及临床治疗提供依 据。 方法 通过收集三年大兴区辖区定点医院肠道门诊腹泻病人的粪便标本,依照GB4789.6-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》和WS271-2007《感染性腹泻诊断标准附录B.2 肠致泻性大肠杆菌检验》进行检验,在传统生化分离培养基础上采用实时荧光PCR方法对菌株进行鉴定,并对分离出的菌株做出分析。 结果 三年共检测标本1049件,检出致泻大肠埃希氏菌75株(7.15%),多数基因型别均有检出,肠道集聚性大肠埃希氏菌(EAEC,3.91%)检出率最高,其次为产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC,2.29%),有3株菌为双重菌合并感染,；1~10岁年龄组感染率最高(13.91%),年龄组别有统计学差异,男女感染无显著性差异；药敏试验结果耐药程度差异较大,耐药率最高的抗菌药物为红霉素(100%),其次为氨苄西林(87.1%)。结论 致泻大肠埃希氏菌在腹泻病人中感染率较高,其不同型别致病性、毒力、引起的症状均有不同,临床治疗也有差异,关注致泻大肠埃希氏菌感染情况更多要关注不同基因型别的感染状况,对预防和治疗意义更大。     

佳木斯市食品中致泻性大肠埃希菌的耐药性与同源性研究

目的 了解佳木斯市食品中致泻性大肠埃希菌的耐药性与同源性,为有效控制食源性疾病发生与临床治疗提供依据。方法 利用多重聚合酶链式反应(PCR)检测食品中的致泻性大肠埃希菌, 并利用Sensitire微生物药敏分析系统和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株耐药性及同源性。 利用 Sensitire 微生物药敏分析系统对佳木斯市食品中分离的致泻性大肠埃希菌进行耐药性分析,并使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性。结果 在1 320份食品中分离出致泻性大肠埃希菌51株,检出率为3.86%;其中21株致泻性大肠埃希菌具有耐药性,耐药率为41.18%,包括3株单重耐药和18株菌多重耐药。51株致泻性大肠埃希菌共获得49个不同PFGE指纹图谱,同源性为38.6%～100.00%。结论 佳木斯市食品中致泻性大肠埃希菌存在多重耐药现象,且分布呈多态性。     

Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d~7 d缩短为仅需2 h~3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。     

多重PCR联合同源加尾技术检测四种食源性致病菌

[目的]建立快速、准确检测食品中沙门氏菌、大肠埃希氏菌0157、副溶血性弧菌、单增李斯特菌的多重荧光PCR方法。[方法]分别以沙门氏菌、大肠埃希氏菌0157、副溶血性弧菌和单增李斯特菌的fimY、rfbE、ToxR和hly作为靶基因,将上下游引物采用同源加尾的方式,构建四重荧光PCR体系,分析该体系的特异性、灵敏度,并进行模拟污染实验,将该方法与国家标准检测方法进行方法比对实验。[结果]该体系成功地检测出了四种目标致病菌。初始菌浓度分别为2、3、8、1CFU／m1的沙门氏菌、大肠埃希氏菌0157、副溶血性弧菌和单增李斯特菌增菌液,在增菌18h后均被检出。[结论]采用同源加尾的方法成功构建了同时检测四种致病菌的多重荧光PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高。     

聚合酶链式反应和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定克罗诺杆菌

目的 采用聚合酶链式反应(PCR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术快速鉴定克罗诺杆菌的方法,实现对该菌显色培养基上生长的可疑菌落高通量、低成本初筛。方法 通过内转录间隔区(its)基因设计针对克罗诺杆菌的属特异性引物,以7株参考菌株为对照,对2013年国家食品安全污染物监测网上报、初步鉴定为克罗诺杆菌的214株菌株进行复核鉴定。同时随机挑选其中84株菌,采用MALDI-TOF-MS技术和VITEK革兰阴性细菌鉴定卡鉴定。结果 7株参考菌株的PCR结果与对应大小一致,214株待测菌株PCR结果均为阳性。84株菌MALDI-TOF-MS和VITEK鉴定的结果均为克罗诺杆菌,符合率为100%。结论 PCR和MALDI-TOF-MS技术具有高通量、低成本、耗时短等优势,可以实现大量可疑菌落的初筛,为我国克罗诺杆菌的监测和防控提供技术支持。     

运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌

目的运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌,以提高检验准确度。方法采用传统的增菌、选择性培养、生化鉴定方法进行样品检验,实时荧光PCR法作为辅助手段对BPW增菌液及可疑菌落进行扩增,最后用API20E鉴定系统对可疑菌落进行确认。结果 3个样品经增菌、选择性培养、生化鉴定后均无显著符合沙门氏菌菌落特征及生化特征的可疑菌落;缓冲蛋白胨水增菌液实时荧光PCR法扩增结果表明样品S02为可疑样品,其分离得到的菌落S02-4有典型扩增曲线;经API20E鉴定系统确认,样品S02为阳性样品,阳性菌为猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种。结论实时荧光PCR法操作简单,准确度高,可作为传统检验方法的有效补充。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分离鉴定生鲜猪肉中沙门氏菌/大肠杆菌类似菌

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中出现的类似菌。方法在郑州市不同地区分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,选择性培养基HE和EMB对细菌进行分离纯化。通过MALDI-TOF-MS技术对疑似菌落进行鉴定;提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS鉴定出的细菌种类,参考Gen Bank中相关菌株的已知基因序列分别设计引物,进行PCR扩增、测序和序列比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。结果经MALDI-TOF-MS方法鉴定,从68个疑似菌株中分别检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异变形杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)3株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR结果与MALDI-TOF-MS鉴定结果完全一致。结论 MALDI-TOF-MS可用于生鲜猪肉检验过程中大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定。本次共检出6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,说明在生鲜猪肉中存在着一定程度的条件致病性肠道细菌污染,因此具有一定的食品安全风险。     

克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的分离与鉴定能力验证结果与分析

目的 通过参加“奶粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力验证计划”,验证实验室对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力,提高实验室检测技能。方法 依据GB 4789.40-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》中的第一法,对能力验证样品进行检验,对分离出的可疑菌落进行生化鉴定,同时用BIOLOG鉴定系统对可疑菌落进行鉴定。 结果 编号G785和编号V995的两个能力验证样品皆检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 结论 本次能力验证获得满意结果,证明本实验室具备克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。在本次能力验证实验过程中,在以国标法检测的同时,辅以BIOLOG进行鉴定,与传统生化鉴定结果互为印证,提高了检测结果的准确性,对以后的检测工作具有一定的参考价值。     

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

大肠埃希氏菌O157和O111能力验证样品的研制

目的研制植物源性成分绿豆基质中O157和O111检测能力验证样品,建立有效的样品制备流程来考核实验室检测致泻大肠埃希氏菌O157和O111的能力,根据参加实验室检测结果是否准确及可靠来评价实验室检测水平,并促进实验室检测体系进一步完善。方法选用O157和O111的ATCC标准菌株制备样品,以绿豆粉为基质,真空冷冻干燥技术制备样品。采用显色培养基、荧光定量PCR、全自动细菌生化鉴定仪、VIDAS全自动免疫荧光分析仪和血清型鉴定进行定性检测,并进行菌落计数。结果随机选取每一批阳性样品中的30个样品,每个样品中目标菌数在21~60 CFU之间,并且A组与B组阳性样品中均检测出目标菌,而阴性样品中均没有出现目标菌。结论表明采用本方法制备的能力验证样品均一稳定,能较好地评价实验室致泻大肠埃希氏菌O157和O111的检测能力。     

食品检测能力验证中沙门氏菌的分离鉴定

目的 参加编号为CFAPA-375的食品中沙门氏菌能力验证,提高检验技能,验证实验室沙门氏菌的检测能力。方法 采用国标法对沙门氏菌能力验证样品进行检测,同时采用实时荧光PCR法作为辅助方法。对分离出的可疑菌落,采用全自动微生物鉴定系统和实时荧光PCR法进行全面鉴定。结果 样品N1和N3中检出沙门氏菌,样品N2中未检出沙门氏菌,实时荧光PCR法与国标法检测结果一致。结论 本次实验室的能力验证结果为“满意”,验证了实验室沙门氏菌的检测能力。实时荧光PCR法快速、简便、特异性强,可与国标法配合使用,以确保实验结果的准确快速。