人乳头瘤病毒16型L1 N-端主要抗原基因的原核表达

目的　获得序列正确的人乳头瘤病毒 (HPV) 16型L1N -端主要抗原基因 ,构建其原核表达载体 ,并进行诱导表达。方法　采用PCR法从宫颈癌组织中获得HPV16型L1N 端主要基因重组表达质粒 ,转化E .coliDH5α ,4 2℃诱导表达 ,Westernblot分析表达产物。结果　获得了序列正确的人乳头瘤病毒HPV16型L1N -端主要基因 ,相对分子质量约为 5 10 0 0。表达蛋白能与乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应。结论　已成功构建HPV16型L1N -端主要基因表达载体 ,并获得有效表达。     

HPV 16 L1天然变异体在毕赤酵母中的可溶性表达及病毒样颗粒装配

目的在毕赤酵母中表达两个临床人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型毒株主要衣壳蛋白L1(HPV 16 L1),并分析表达产物的可溶性及病毒样颗粒(virus-like parcticle,VLP)装配差异。方法将编码两个不同HPV 16毒株L1蛋白的全长基因序列M16和Y16分别重组于毕赤酵母表达载体p Pink LC,构建重组表达质粒Y16LC和M16LC,转化表达菌株p Pink strain 1。重组菌经甲醇诱导后,Western blot分析L1蛋白的表达水平及可溶性。经密度梯度离心结合透射电镜观察,分析VLP装配情况。通过软件pubmed在线Alignment分析两个序列的氨基酸排列。结果两个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证明构建正确。两个序列获得了相似的蛋白表达水平,但Y16的可溶性较差,几乎且无VLP形成;而M16呈现较好的蛋白可溶性及VLP装配能力。Y16与M16有5个氨基酸的差异(H202D、T266A、Δ424S、D441Δ、K452Q)。结论 HPV 16 L1氨基酸的微小改变尽管未对重组蛋白的表达水平产生影响,但显著影响有功能的预期产物的获得。提示在基因重组病毒疫苗研发中,制备VLP时需考虑毒株的选择,甚至主动进行抗原的特定氨基酸的改造。     

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的克隆人乳头状瘤病毒16型(HPV16)L1/E7嵌合蛋白基因,并在毕赤酵母中表达。方法PCR扩增HPV16L1/E7基因,并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3·5K和pPIC-9K中,构建含HPV16L1/E7基因的pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,经测序证实插入的外源基因读码框正确后,分别转入GS115和KM71菌株中,筛选阳性转化菌株,经PCR鉴定,甲醇诱导表达HPV16L1/E7嵌合蛋白,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,电镜观察,并经离心法纯化VLPs。结果HPV16L1/E7基因已成功插入pPIC-3·5K和pPIC-9K载体中,共获得6株KM71HPV16L1/E7-pPIC3·5K、5株GS115HPV16L1/E7-pPIC3·5K、1株KM71HPV16L1/E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1/E7-pPIC9K阳性转化菌株,并可表达相对分子质量约为69000的蛋白,与预期值一致。表达量约为0·35~1·04mg/ml。Westernblot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100%。结论已成功构建了pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白VLP的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。     

治疗性乙型肝炎病毒载体疫苗的构建

目的研制治疗慢性乙型肝炎的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)载体疫苗。方法将HBV的表面抗原基因克隆到MVA病毒的重组载体pSC11上,重组质粒与空MVA病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。经过10轮筛选,挑选出阳性的重组MVA病毒。经PCR鉴定,感染不同细胞系,确定病毒表达量。结果获得目的重组MVA病毒,ELISA检测到表面抗原在不同细胞系中的表达。结论已成功地构建了表达HBV表面抗原的重组MVA病毒。     

利用翻译延伸因子1-α启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒16L1蛋白

目的利用翻译延伸因子1-α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白。方法从毕赤酵母GS115中扩增组成型TEF1-α启动子(PTEF1-α)基因,通过基因重组替换商业化表达质粒pPink-HC和pPink-LC的启动子PAOX1;在PTEF1-α下游分别克隆绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和HPV 16 L1基因,构建重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1;将重组质粒电转化感受态毕赤酵母PichiaPink strain 1,培养不同时间后,荧光显微镜下观察GFP的表达;分别在YPD、YPG、YPM、YPSor培养基中培养pTEF-16 L1转化菌,检测菌体在不同培养基中的增殖情况;Western blot检测HPV 16 L1蛋白的表达水平。结果重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1经双酶切鉴定和序列分析表明构建正确;荧光显微镜检测显示,在不同培养时间PTEF1-α指导了GFP的成功表达,且表达量随培养时间的延长而降低;重组毕赤酵母在YPD和YPG培养基中生长迅速;4种培养基中均有HPV 16 L1蛋白的特异性表达,且在YPG和YPSor培养基中获得了HPV 16 L1蛋白较持续的表达。结论成功实现了组成型启动子PTEF1-α控制的HPV16 L1蛋白的表达,为HPV疫苗的低成本及方便生产提供了一个可供选择的有效方案。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白真核表达质粒的构建

目的克隆宫颈癌病理组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期蛋白(L1)的基因,并构建真核表达质粒,为制备预防性疫苗奠定基础。方法采用PCR法从宫颈癌病理标本中扩增出HPV16-L1基因,与pMD18T载体连接,测序并构建真核表达质粒(pVAX1L1),瞬时转染Cos7细胞,利用免疫组化技术检测表达产物。通过小鼠淋巴细胞转化试验检测免疫原性。结果所得L1基因的序列与GenBank中序列比较存在若干变异,并由此引起相应的氨基酸发生变化。pVAX1-L1瞬时转染Cos7细胞,经免疫组化技术检测到棕黄色免疫复合物的形成,说明有表达产物L1蛋白产生。淋巴细胞转化试验结果显示,试验组与对照组差异有显著意义。结论宫颈癌病理组织中HPV16L1基因序列存在一定程度的变异,所得L1基因表达产物具有生物学活性。     

人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1在大肠埃希菌中的表达

目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合表达质粒,转化不同宿主菌(大肠埃希菌DH5α、BL21),在不同的温度下(37、20℃)进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。     

人乳头瘤病毒16型嵌合病毒样颗粒体外形成实验方法的建立

目的建立人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型嵌合病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)体外形成实验的方法。方法以HPV16型L1为模板,将两个L2保守序列(aa56~75,aa108~120)分别插入L1两个可插入位点(DE袢状区,h4状区),构建出4种嵌合蛋白基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统表达嵌合的4种VLP蛋白,经蔗糖密度梯度离心纯化,纯化的目的蛋白进行VLP体外解聚重聚实验,Western blot分析体外解聚重聚前后的蛋白。结果表达及纯化的4种HPV16 L1-L2嵌合蛋白相对分子质量均约60 000,大小与预期相符;经VLP体外解聚重聚实验,使不能很好自组装的4种HPV16 L1-L2嵌合蛋白组装形成VLP,并具有免疫原性。结论建立的方法有助于HPV嵌合VLP的形成,能够明显提高其组装效率,为以L2蛋白为目标的第二代HPV疫苗的嵌合VLP体外组装提供了可行的实验方法。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

人乳头瘤病毒结构蛋白L1与白色念珠菌甘露糖蛋白CTL表位嵌合基因在昆虫细胞中的表达

目的构建携带人乳头瘤病毒(HPV)结构蛋白L1和白色念珠菌甘露糖蛋白(CaMp65)细胞毒性T细胞表位(CTL)基因的重组质粒,并在杆状病毒-昆虫细胞系统中进行表达。方法分别设计包含HPV6bL1和CaMp65CTL145-153的引物,经PCR扩增嵌合基因HPV6bL1/CaMp65CTL145-153,并进一步将其插入杆状病毒表达载体pFastBacTM1。在E.coliDH10Bac中组装成重组杆状病毒,在昆虫细胞sf-9中表达嵌合蛋白,并经SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定。结果HPV6bL1/CaMp65CTL145-153嵌合蛋白在昆虫细胞sf-9中得到了表达,表达产物的相对分子质量为56000,与HPV6bL1单抗能产生特异性反应。结论HPV6bL1/CaMp65CTL145-153嵌合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了成功表达,为防治HPV和白色念珠菌感染的基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

58型人乳头瘤病毒L2蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化我国高发的致宫颈癌58型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)次要衣壳蛋白L2,并制备其单克隆抗体。方法从含有HPV-58基因组的质粒pHPV58中扩增L2基因,插入改构的原核表达载体pGEX-KGV中,转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达,透析复性并亲和层析纯化重组蛋白,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果重组表达质粒pGEX-KGV-HPV58 L2经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量可占菌体总蛋白的15.5%;纯化的重组蛋白纯度可达95%;共获得10株抗HPV-58 L2的高效价单克隆抗体。结论已成功原核表达、纯化了HPV-58 L2重组蛋白,并制备了单克隆抗体,为下一步HPV-58 L2蛋白抗原表位的研究以及相关预防性抗体药物和广谱重组疫苗的开发奠定了基础。     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达、纯化狂犬病病毒(Rabies virus,RV)核蛋白(Nucleoprotein,NP),并检测其免疫原性。方法 RT-PCR扩增RV CVS-11株NP全长基因序列,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-N,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+柱亲和层析纯化后,进行Western blot分析,并分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平。结果重组原核表达质粒pET-30a-N经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约51 800,表达量约占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RV小鼠血清特异性结合,分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体滴度对数的GMT值(3.81±0.22和3.68±0.20)明显高于阴性对照组(1.25±0.22),且差异均有统计学意义(P<0.01)。结论已成功表达并纯化了RV NP,其免疫原性良好,为进一步研究其功能奠定了基础。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在CHO细胞中的表达及其免疫学特性

目的在CHO细胞中表达Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus-2,HSV-2)糖蛋白D(Glycoprotein D,gD),并检测其免疫学特性。方法采用Vero细胞培养HSV-2,提取总DNA,以其为模板,PCR扩增gD基因,与pCMV-sport载体连接,构建重组表达质粒pCMV-gD,将质粒pCMV-gD转染COS-7和CHO-K1细胞,并进行表达。亲和胶Anti-flag M2 Agarose纯化表达蛋白,经SDS-PAGE和HPLC分析重组蛋白纯度,Western blot分析蛋白反应原性,全波长扫描分析蛋白的光谱曲线,等电聚焦电泳测定蛋白的等电点。以20、40μg纯化的gD免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中HSV-2 gD特异性抗体水平,中和试验测定小鼠血清中和抗体水平。结果酶切鉴定及DNA测序表明,重组表达质粒pCMV-gD构建正确,在COS-7细胞的瞬时表达产物和CHO细胞中的稳定表达产物均可被HSV-2 gD单抗特异性识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。纯化的gD在相对分子质量约5 500处可见目的蛋白条带,纯度为65.46%;保留天然HSV-2 gD的反应原性,最适紫外吸收波长为275.50 nm,等电点为8.3。gD 20μg组和40μg组小鼠血清特异性抗体滴度分别为1∶125 000和1∶16 000,中和抗体滴度分别为1∶17和1∶16,表明gD可诱导中和抗体的产生,也可诱导高滴度的HSV-2gD特异性抗体。结论成功在CHO细胞中稳定表达了HSV-2 gD,表达的HSV-2 gD具有较好的免疫原性,为基因工程疫苗的开发奠定了基础。