抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂的种类及活性的研究进展

作为一类新型的抗流感病毒药物神经氨酸酶抑制剂(NIs),能够阻止病毒颗粒在宿主细胞内复制和释放,并对流感病毒具有较高的选择特异性,能够有效地预防、治疗流感和缓解症状。文章综述了NIs的作用机制,重点归纳了NIs的种类及其抑制活性,为开发研究抗流感病毒药物提供有用的信息和参考。     

流感病毒药物研究进展

2009年,甲型H1N1流感病毒引发的全球性流感爆发给予我们一个警示:目前的医疗手段在控制流感病毒传染方面很薄弱。目前,流感的预防和治疗措施主要是流感疫苗。然而,从流感病毒株的识别到疫苗的开发有6个月的滞后期并且疫苗的安全性问题也越来越多被关注,因此使常规流感疫苗预防流感爆发与阻止流感传播的有效性受到严重影响。从短期效果来看,化学药物的治疗在控制流感病毒传染中起着至关重要的作用。目前,临床上用于抗流感病毒的药物只有四个:神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦,M2离子通道抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺。在2009年流感大爆发,而疫苗未能起效时,神经氨酸酶抑制剂发挥了重要的作用。可是,由于耐药的变异病毒株不断涌现仍然导致这些药物的药效降低。因为我们不能预测未来爆发的流感病毒亚型,所以开发针对所有病毒亚型都有效果的广谱抗流感病毒药物以及推广多种药物治疗是很有必要的。在文章中,我们综述了临床在研的抗病毒药物(长效神经氨酸酶抑制剂,聚合酶抑制剂法匹拉韦[T-705]),以及能够同时作用于病毒(血凝素抑制剂蓝藻抗病毒蛋白-N和噻唑立德)或宿主(司他弗林,硝唑尼特)的临床前药物。     

神经氨酸酶抑制剂研究进展

流感是由流感病毒引起的呼吸道传染病。对人类的健康危害极大。神经氨酸酶(NA)在流感病繁殖过程起重要作用,通过抑制NA可阻止流感的蔓延,从此神经氨酸酶成了抗流感病毒药物理想的进攻靶点,基于神经氨酸酶与底物的酶促活性结构合理设计的神经氨酸酶药物相继上市,该文对扎那米韦,奥斯米伟及帕拉米韦高活性衍生物的研究做了综述。     

表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的重组腺病毒的构建及其免疫原性

目的构建表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的重组腺病毒,并检测其免疫原性。方法从质粒pMD19T-simple-NA中扩增NA基因,克隆至穿梭质粒pShuttleCMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-NA,RT-PCR和免疫荧光法检测NA基因在Vero细胞中的转录和表达。CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒,免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗NA抗体滴度。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定表明带有目的基因的穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中;NA基因在Vero细胞中成功转录和表达;重组腺病毒可刺激小鼠产生抗NA抗体,初免后4周,抗体水平达最高,为1∶100 000。结论成功构建了表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白的重组腺病毒,其可刺激小鼠产生有效的免疫应答,为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

帕拉米韦合成工艺改进研究

帕拉米韦系合成的一种环戊烷类抗流感病毒药物,属新型流感病毒NA抑制剂,在文献研究的基础上,对帕拉米韦的合成工艺进行了优化和改进,主要包括制备(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-氨基-2-乙基丁基]-4-[叔丁氧羰基氨基]-2-羟基-环戊烷羧酸甲酯及帕拉米韦等步骤。本研究选用红铝甲苯溶液代替传统工艺方法中的贵金属催化加氢和氢化铝锂还原的条件,优化了反应方案;在进行甲酯化时,采用连续化反应,可以短时有效的在稳定pH下反应,抑制了BOC的脱除,减少了再次上氨基保护的步骤。采用改进和优化后的新工艺,产率提高,成本降低,环境友好,符合绿色现代化生产要求,为大规模工业化生产提供客观理论依据与实验论据。     

抗流感药物三足鼎立局面将被盐酸阿比多尔打破

一直以来，抗流感病毒药物市场都以奥司他韦、金刚烷胺、金刚乙胺三足鼎立，但随着盐酸阿比多尔的上市，这种维持多年的格局已被打破，盐酸阿比多尔这位新成员已经成为抗流感病毒药物的中坚之一。[第一段]     

流感病毒裂解疫苗生产用毒株传代稳定性分析

目的分析流感病毒裂解疫苗生产用H1N1、H3N2和B型流感病毒毒株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液的传代稳定性。方法对制备的H1N1、H3N2和B型流感病毒毒株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液进行全面的生物学特性检定;采用RT-PCR法从3个型别流感疫苗生产用毒株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增血凝素(hemagglutinin,HA)及神经氨酸酶(neuramidinase,NA)基因片段,进行全基因序列测定分析。结果制备的3个型别流感病毒毒株主种子批、工作种子批和疫苗病毒收获液的抗原性与WHO推荐毒株相一致,生物学特性均符合《中国药典》三部(2010版)标准;HA及NA基因核苷酸序列、氨基酸序列均一致,除H3N2型毒株的NA基因序列外,均与GenBank中登录的相应毒种基因序列同源性为100%。结论本公司流感病毒裂解疫苗毒种制备及疫苗生产工艺,能够保持生产用毒株传代生物学特性的一致性及遗传性状的稳定性。     

B型流感病毒在MDCK细胞上的遗传稳定性

目的研究流感病毒NYMC BX-51B株在MDCK细胞上连续传代的遗传稳定性。方法将SPF级鸡胚制备的流感病毒NYMC BX-51B尿囊液毒株接种至MDCK细胞上,连续传代培养至10代(M1～M10),参照《中国药典》三部(2015版)毒种检定方法进行支原体和无菌检查、外源因子检查、鉴别试验,并进行血凝试验和病毒滴度检测。提取尿囊液、M1代、M10代病毒总RNA,RT-PCR法扩增血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,并进行测序。结果流感病毒NYMC BX-51B株在MDCK细胞上连续传代培养至M10代,血凝滴度最高可达1∶256,病毒滴度最高可达6. 5 LgCCID_(50)/mL;鉴别试验、无菌检查、支原体检查、外源因子检查结果均符合药典要求。尿囊液、M1代、M10代病毒的HA和NA基因的氨基酸序列与GenBank中登录的流感病毒NYMC BX-51B的HA和NA基因比对结果完全一致。结论 NYMC BX-51B型流感病毒在MDCK细胞基质上连续传代培养至M10代,遗传稳定性良好,为MDCK细胞基质流感疫苗的研究和生产奠定了基础。     

那他霉素微胶囊的制备及性能测试

[目的]利用微胶囊技术提高那他霉素(NA)的抗光解性能.[方法]复凝聚法,以明胶和阿拉伯胶作壁材,以正交试验优化工艺,测试微胶囊释放和抗光解.[结果]优化工艺为壁材质量浓度20 g/L、芯壁比1.5∶1、反应pH值4.5、反应时间90 min;以水和30％甲醇溶液为释放介质,微胶囊具良好的通透性和缓释性;在紫外光下,NA微胶囊相对活性下降50％的时间为79 min,较NA浓缩液和NA悬乳剂(含UV-531)分别提高3.0倍和1.1倍.[结论]NA微胶囊可显著提高NA的抗光解性能,作为农用杀菌剂具较大潜力.     

马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白的制备及其治疗效果评价

目的制备马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白,并评价其对BALB/c小鼠的治疗效果。方法应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别构建的表达H7N9亚型流感病毒HA、NA及M1蛋白的病毒样颗粒制备抗原,免疫健康马匹,当抗体效价达1∶10 000以上时,采血,对血清进行粗处理;采用亲和层析的方法获得纯化的马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2。对纯化的免疫球蛋白进行蛋白含量测定和质量检测。用H7N9亚型流感病毒BALB/c小鼠感染模型评价F(ab’)_2的治疗效果。结果免疫马匹血清中产生高滴度的中和抗体,获得的纯化马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2中和抗体效价达1∶5 120,质量检测合格。攻毒4 h后给药0.4和0.2 mg,小鼠存活率均达100%。结论获得了安全、高效的马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab’)_2,为人禽流感治疗用制剂的研发提供了参考。