高产淀粉酶和蛋白酶的黑曲霉菌株的发酵条件优化

本文分离筛选到一株高产蛋白酶和淀粉酶黑曲霉菌株A020,确定该菌的最佳产酶培养基为：香蕉皮基础培养基中添加1%蛋白胨、1%麦芽糖和3×10-3 mol/L NaCl;最佳发酵条件为：30 ℃、pH 6.5、装液量150 mL/500 mL。在此条件下,150 r/min摇瓶培养4 d,测得淀粉酶、蛋白酶酶活分别为1278 U/mL和918 U/mL,淀粉酶和蛋白酶的酶活分别比优化前提高了68.2%、41.2%。     

高产中/碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌W1菌株的筛选及条件优化

为了筛选高产蛋白酶活性细菌,以大豆及其发酵制品为目标样品,采用酪蛋白平皿筛选到一株既可产中性蛋白酶又可产碱性蛋白酶的细菌菌株W1,经形态学及16S rDNA基因序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. Subtilis),其产中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力分别为28.99 U/mL和33.19 U/mL。通过单因素试验对其产蛋白酶的培养条件进行初步优化,并在此基础上以总蛋白酶活力为指标对其产蛋白酶条件进一步进行正交试验优化,最佳条件为培养基初始pH 9.0,接种量4%,培养温度35℃,培养时间48 h,此条件下中性蛋白酶活力为40.39 U/mL,碱性蛋白酶活力为52.02 U/mL,总蛋白酶活力为92.41 U/mL,优化后相应酶活力分别提高了39.3%、56.7%和48.6%,这将为枯草芽孢杆菌W1菌株蛋白酶的酶学性质研究提供帮助,同时也是对蛋白酶活性枯草芽孢杆菌资源库的丰富。     

豆乳凝固酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究

从黄水中分离到1株分泌胞外豆乳凝固酶的霉菌———毛霉HS-D11,将该菌在30℃、150r/min培养2d,再在25℃静置培养2d~3d,所获得的粗酶液中蛋白酶水解活力仅为0.3U/mL,豆乳凝固活力高达1.16U/mL。该酶最适温度65℃,最适pH5.9,0.5mL粗酶液10min内可使5mL豆乳凝固成型,倒置不流出。     

产低温蛋白酶酵母菌株的筛选及发酵培养基优化

该研究从新疆本地分离获得的200株酵母菌中筛选产低温蛋白酶的菌株,并通过形态观察、生理生化试验及分子生物学方法 对菌株WLY1、WLY2和MLY1进行鉴定,最后通过响应面法对20 ℃条件下蛋白酶活力高的菌株的发酵培养基配方优化。 结果表明, 共筛选到14株产低温蛋白酶菌株,其中3株（WLY1、WLY2和MLY1）于20 ℃条件下仍具有较强的产低温蛋白酶能力,其蛋白酶酶活 力依次为69.03 U/mL、34.20 U/mL、29.70 U/mL;鉴定菌株WLY1、WLY2和MLY1分别为双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidium diobo- vatum）、Cryptococcus adeliensis、Barnettozyma californica;其中菌株WLY1产低温蛋白酶能力强,且其最佳产蛋白酶培养基配方为酵 母浸粉1.64%、蛋白胨1.21%、干酪素1.48%。在此最优条件下,菌株WLY1的蛋白酶活力达到251.51U/mL,约为优化前的4倍,同比其 他产蛋白酶功能菌具有较大的工业应用潜力。     

土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定。经筛 选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL。 通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析, 鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。 通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件：大豆粉3.0%、 蔗糖3.0%、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h。 在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提 高15.3倍。 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa。     

天山冰川假单胞菌产低温脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

针对一株从天山一号冰川沉积层中得到的假单胞菌T1-39,优化其产低温脂肪酶发酵条件,研究低温脂肪酶部分酶学性质,采用p-NPP法测定酶活力,设计产酶培养基成分及培养条件。确定产酶培养基成分为:葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、K2HPO4 2 g/L、橄榄油乳化液50 mL/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。优化后培养条件为250 mL摇瓶装液量为20 mL,培养温度15℃,初始pH为9。在优化发酵条件下,菌株发酵液低温脂肪酶酶活力可达到9.77 U/mL,较优化前(3.14 U/mL)提高了3.11倍。粗酶液最适反应温度为30℃,在60℃处理30 min后仍有40%的酶活,最适pH值为9,Mg2+、Zn2+、Ni2+、Ba2+对粗酶液有激活作用,而Sn2+、Cu2+对酶活均有不同的抑制作用。     

酶解虾壳蛋白制备ACE 抑制剂的工艺优化

以虾壳粉为原料,以水解度和ACE抑制率为指标,利用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解,其中中性蛋白酶和碱性蛋白酶有较高的ACE抑制活性,因此对碱性蛋白酶和中性蛋白酶的工艺条件进一步优化。结果表明：碱性蛋白酶酶解工艺优化条件为：温度60℃、pH9.5、底物质量浓度2.5g/100mL、加酶量4000U/g、酶解时间2.5h,在此条件下ACE抑制率最高,为67.70%,水解度为69.79%;中性蛋白酶酶解工艺优化条件为：温度50℃、pH7.0、底物质量浓度2.5g/100mL、加酶量2000U/g、酶解时间2h,在此条件下ACE抑制率最高,为84.04%,水解度为26.76%。提示中性蛋白酶酶解能够产生更多的ACE抑制肽,是酶解虾壳蛋白制备ACE抑制肽的较优酶。     

一株产大豆蛋白酶的芽孢杆菌发酵条件的优化

对一株产大豆蛋白酶芽孢杆菌(Bacillussp.D-16-9)的发酵条件进行了优化,研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成。结果发现菌株D-16-9可以利用无机氮源生长,但用来产酶则很差;有机氮源利于生长和产酶,适当添加诱导物更利于产酶;酶合成模式属于滞后合成型,大量收获在菌体生长的稳定期。通过试验确定发酵培养基的最佳组成:5.0%玉米粉、3.0%大豆豆粕、0.05%氯化钾0、.05%硫酸镁;确定最适发酵条件为:起始pH10,培养温度30℃、种龄24 h、接种量10%,250 mL三角瓶中装入100 mL发酵培养基,摇瓶转速170 r/min,发酵时间120 h。综合最佳的培养基组成和培养条件,最终大豆蛋白酶活达6 500 U/mL。优化后蛋白酶活性由4423.20U/mL提高到6505.60U/mL。     

一株产低温蛋白酶菌株的筛选、鉴定及生长特性的研究

以新疆阿勒泰地区的冻土为原材料,采用平板分离法初筛,测蛋白酶活性法复筛,筛选出9株低温蛋白酶产生菌株,其中菌株A29-2蛋白酶活性最高,为31.88U/mL,且该菌在初始pH 7.0,NaCl质量分数为1.00%,22℃条件下繁殖量最大。通过形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列鉴定,鉴定为:该菌属于沙雷氏菌(Serratia sp.),该菌株所产的蛋白酶在4℃条件下保存48h,酶活力基本保持不变,表明该低温耐冷菌所产的蛋白酶为低温酶。     

葵花籽多肽的制备及其降压活性研究

试验以低温脱脂葵花籽粕为原料,进行脱脂和脱绿原酸处理后,用碱性蛋白酶制备葵花籽多肽。以水解度和ACE抑制率为评价指标,对底物浓度、加酶量、酶解温度、酶解时间和pH值进行单因素试验,在此基础上采用响应面试验优化碱性蛋白酶制备葵花籽多肽的最佳水解工艺。结果表明:底物浓度为15g/mL、加酶量为3 700U/g、酶解温度为56℃和pH值为8.2的条件下水解3h,ACE抑制率可达63.74%。     

多孔壳聚糖固定酵母蛋白酶条件的优化及酶学性质分析

以多孔壳聚糖微球固定酵母蛋白酶,通过对戊二醛含量、吸附时间、固定化温度、pH进行了单因素试验及正交试验,以蛋白酶酶活回收率为评价指标,确定的固定化条件为戊二醛含量1.4%,吸附温度27 ℃,pH值为10,吸附时间24 h。在此最佳条件下,固定化酵母蛋白酶酶活回收率为68.8%。酶学性质分析结果表明,固定化酶最佳反应温度较游离酶升高10 ℃,最佳作用pH较游离酶向碱性方向偏移1个pH单位。因此,用多孔壳聚糖对酵母蛋白酶进行包埋可以提高蛋白酶活性。     

芽孢杆菌NCB-01胞外蛋白酶酶学特性的初步研究

该实验对来自于渤海海域沉积物的芽孢杆菌NCB-01分泌的胞外蛋白酶的酶学特性进行了初步研究。结果表明,该蛋白酶的最适作用温度为60 ℃,最适pH值为8.0,在50 ℃以下及pH值7.0～9.0的范围内酶稳定性良好。该酶具有较好的金属离子耐受能力,Fe2+、K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+对酶活均有不同程度的激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂（PMSF）能强烈抑制该酶的酶活性,表明该蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。非离子型表面活性剂Tween-20、Tween-80及Triton X-100和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对酶活均有较强的抑制作用。该酶具有良好的耐盐性。其米氏常数（Km）为1.11 mg/mL,最大反应速率（Vmax）为91.74 μg/（min·mL）,说明该碱性蛋白酶与酪蛋白的亲和力好,特异性强。     

鱿鱼肝脏蛋白酶的鉴定及组织蛋白酶L的分离纯化

鱿鱼肝脏含有丰富的蛋白酶,为利用其内源蛋白酶进行可控的酶解,本研究以鲤鱼肌原纤维蛋白为底物对鱿鱼肝脏内源蛋白酶的种类和性质进行了研究。反应体系中添加E-64、1,10-菲啰啉和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl?fluoride,PMSF)后,肌球蛋白重链(myosin?heavy?chain,MHC)的降解得到了显著抑制,确定了鱿鱼肝脏含有金属类、半胱氨酸类、丝氨酸类3类蛋白酶。半胱氨酸类蛋白酶热稳定性最好,在50℃以上仍然具有较大活性,可将肌原纤维蛋白酶解成小分子质量的降解产物。利用特异性底物对半胱氨酸蛋白酶种类进行鉴定发现,该酶只酶解Z-Phe-Arg-MCA,添加亮抑酶肽后相对酶活性为0%,添加E-64相对酶活性仅存0.6%,初步确定鱿鱼肝脏中的半胱氨酸蛋白酶主要为组织蛋白酶L。最后,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤对组织蛋白酶L进行分离纯化,在电泳上得到了分子质量约为25?kD单一条带。     

海沃德猕猴桃巯基蛋白酶的催化特性与稳定性

对以海沃德猕猴桃残次果提取的巯基蛋白酶进行了动力学研究,考察了一些外加剂对酶活的影响,同时初步探讨了酶液的稳定性。结果表明:以酪蛋白为底物的猕猴桃巯基蛋白酶的Km值为6.56×10-3mmol,Vmax为163.93mg·mL-1·min-1;在其底物浓度为1.0g/L时,该酶的最适温度和pH分别为55℃和5.5;L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、硫代硫酸钠、EDTA以及葡萄糖等外加剂对酶具有明显的激活效果,且EDTA的激活作用最强;抗坏血酸、碘乙酸和过氧化氢等外加剂对酶则具有抑制作用。在最适酶促反应条件下,于4℃温度存放的酶液活性随时间延长呈急剧的降低,并以pH为3.5存放条件下的降低最少,约可保存80%的酶活性。     

海藻酸钠-阿拉伯胶固定化酸性蛋白酶及其性质的研究

以海藻酸钠（SA）与阿拉伯胶（GA）为载体固定化酸性蛋白酶,以酶活回收率为评价指标,在单因素试验基础上,通过正交试验优化固定化条件。得到以SA-AG复合凝胶为载体制备固定化酸性蛋白酶的最佳工艺条件为：复合凝胶质量浓度3.5 g/100 mL,SA与AG质量比2∶1,氯化钙质量浓度7.0 g/100 mL,固定化时间1.0 h,给酶量1 540 U/g,吸附时间2.0 h,酶液pH值为3.0。此最佳条件下,固定化酸性蛋白酶酶活回收率为67.34%,酶活力为1 380 U/g。固定化酶酶学性质的研究结果表明,固定化酸性蛋白酶的最适作用温度（45 ℃）和最适反应pH值（pH=3）均与游离酶相同,但其热稳定性优于游离酶,且随着温度的升高这种优势越明显。     

酶法水解麦胚蛋白及其产物的抗氧化活性研究

选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶5种蛋白酶对麦胚蛋白进行水解,并考察其水解产物的抗氧化活性。结果表明,中性蛋白酶为制备麦胚抗氧化肽的最适蛋白酶,其最佳水解条件为:底物质量分数4%,酶添加量6 000U/g,酶解温度50℃,pH值7.5,水解至270min时抗氧化活性最大。     

酶解南美白对虾下脚料制备抗氧化酶解液的研究

以南美白对虾加工下脚料(虾头虾壳)为原料,采用内源酶、中性蛋白酶,通过控制pH、水料比、酶解温度、酶解时间和酶用量等条件进行酶解,从而制取抗氧化酶解液,以还原能力、清除羟基自由基能力为指标选择最优的酶解条件。结果表明,内源酶最佳酶解条件为:pH为6,水料比为2∶1,酶解温度为40℃、酶解时间为6h,此时还原力为0.668,·OH清除率为67.24%;中性蛋白酶的最佳酶解条件为:酶用量为60U/g原料,pH为6,水料比为2∶1,酶解温度为60℃、酶解时间为5h,此时还原力为0.672,·OH清除率为68.43%。在最佳酶解条件下,两种酶解液的还原力与·OH清除率大小排列为:中性蛋白酶>内源酶,但两者相差不大,从经济能源的综合因素考虑,选用内源酶较合适。     

酒曲中高蛋白酶产生菌筛选及酶学性质研究

利用脱脂牛奶平板法从宋河酒曲中分离得到6株有明显水解圈的蛋白酶产生菌,其中水解圈直径与菌落直径之比最大为8.84,经鉴定为芽孢杆菌。以此菌种通过发酵培养提取出粗酶液,然后对该蛋白酶的酶学性质进行研究。试验表明,该蛋白酶的最适酶活力温度为40℃,在40℃～50℃热稳定性较好;该蛋白酶最适pH值为11.0,在pH值为9.0～11.0稳定性较好,在pH6.0条件下酶活力很快丧失;金属离子Fe2+对该蛋白酶有激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb+有抑制作用,Mg2+、Ca2+和Li+对该蛋白酶酶活性影响不大。     

海藻酸钠固定化碱性蛋白酶制备及酶学性质的研究

对采用海藻酸钠固定化碱性蛋白酶的方法和酶学性质进行了研究。在单因素实验基础上,采用响应面优化方法确定固定化的最优条件,得到的最佳条件为:海藻酸钠浓度3.1%,pH9.4,CaCl2浓度3.0%,游离酶添加量10000U/g,时间1.8h,固定化酶活力可达5518U/g。固定化酶的最适pH为10,最适温度为60℃,制得的固定化酶的热力学稳定性和操作稳定性较好。此外,固定化酶重复利用5个循环后酶活力仅降低40%。     

皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究

从鲍鱼内脏提取β-1,3-葡聚糖酶粗酶并研究其酶学性质。以昆布多糖为底物监控酶的活性。鲍鱼内脏经匀浆后,采用3倍体积0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)浸提12h。浸提液经离心后收集上清液,并采用60%饱和度的硫酸铵对上清液中的蛋白进行盐析沉淀得β-1,3-葡聚糖酶粗酶。研究表明,粗酶中β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为40℃,酶活力在40℃以下稳定;酶的最适pH为6.0,酶活力在pH4.0～7.0范围内稳定。Mn2+能明显激活酶活力,而Cu2+、Fe3+、Hg+对酶活力有抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最强;亮肽酶素和1,10-菲啰啉对酶活力有明显的抑制作用,而E-64对酶活力有一定的激活作用;此酶对海藻酸钠也有一定水解能力。