三相法从苦杏仁中分离制备β-葡萄糖苷酶

为了提高苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化度和酶活回收率,采用三相法从苦杏仁粗酶提取液中制备β-葡萄糖苷酶。分别研究了有机溶剂种类及浓度、硫酸铵饱和度、p H和温度对三相分离过程的影响。结果表明:叔丁醇为最佳有机溶剂,粗提物与叔丁醇的体积比为1.0∶1.5,硫酸铵饱和度为50%,体系p H=5.0,最佳温度为25℃。在该优化条件下,苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化倍数达到5.97,酶活回收率为85.7%。     

三相法制备木瓜蛋白酶的过程研究

为了高效制备木瓜蛋白酶,利用三相分离法对番木瓜乳粉进行分离纯化。对影响分离纯化的主要因素有机溶剂种类及浓度、硫酸铵质量分数、三相成相时间及pH等进行了研究。实验结果表明,该酶的最佳分离条件为:粗酶液与叔丁醇的体积比为1∶1.5,硫酸铵质量分数为50%,成相时间为60 min,体系pH为7.0。在此条件下使用三相法分离出的木瓜蛋白酶纯化倍数为2.98倍,酶活回收率为76%。     

超滤离心在双水相萃取大肠杆菌谷氨酸脱羧酶中的应用

建立聚乙二醇(PEG)/磷酸氢二钾(K2HPO4)双水相体系,通过对大肠杆菌(Escherichia coli AS1.505)细胞进行超声波破碎制得谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)酶液,并利用双水相萃取对GAD进行分离纯化,然后,采用超滤离心对双水相上相中的GAD与PEG进行分离并分别回收。实验结果表明,大部分GAD分配于上相,其纯化倍数为55.60,酶活率为97.78%。通过响应面分析,对超滤离心工艺参数进行优化,确定了超滤离心转速为10 000 r/min,离心时间为20 min,混合液的稀释倍数为5倍,此条件下GAD的回收率为81.52%,PEG的回收率为84.41%。     

幽门螺杆菌尿素酶的纯化和鉴定

幽门螺杆菌超声波上清经DEAE SepheroseFastFlow和PhenylSepheroseCL 4B两步柱层析得到纯化的Hp尿素酶 ,免疫印迹显示有良好的抗原性。在pH8.0和 45℃条件下酶比活约为 2 6 5U mg ,SDS PAGE显示有 6 0 0 0 0和 30 0 0 0两个亚单位。经两步柱层析纯化后 ,Hp尿素酶回收率为 30 % ,纯化倍数达 11倍。连续纯化 3批显示工艺稳定 ,为Hp尿素酶基础研究和应用奠定基础。     

硫酸铵-丙酮协同沉淀法纯化南极假丝酵母产脂肪酶

采用硫酸铵-丙酮协同沉淀法,对南极假丝酵母产脂肪酶(CALB)进行了分离纯化研究.经正交实验确定纯化工艺为:向酶液中加入硫酸铵至饱和度45%的同时加入0.3倍酶液体积的丙酮;离心后再向上清液中加入硫酸铵至饱和度75%,分相后,相界面处沉淀即为脂肪酶粗品.经分离纯化后,酶活回收率为54%、纯化倍数为2.72.     

粪产碱杆菌D-氨基酰化酶的分离纯化及发酵条件优化

采用热激法将含粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因载体的质粒导入大肠杆菌,筛选重组子,对该工程菌产生的D-氨基酰化酶用Ni 2+柱进行分离纯化;通过单因素实验优化D-氨基酰化酶的发酵条件。结果表明,纯化后的D-氨基酰化酶比活力为456.71U·mg-1,纯化回收率为50%,纯化倍数为12.4倍;最佳发酵条件为:37℃通气培养至菌体浓度OD600值为0.6时,加入0.5mmol·L-1诱导剂IPTG诱导5h,在此条件下,D-氨基酰化酶酶活力为90.9U·mL-1。     

1,3-丙二醇脱氢酶-步纯化与杂化凝胶固定化的初步研究

转录表达来源于Klebsiella.pl,3-丙二醇脱氢酶(PDH)基因片段的E.coli工程菌,在5L发酵罐、30℃、pH值7.0、200r/min(微氧)条件下培养20h;发酵菌体经破碎分离后所得样品通过HisTrap HP柱亲和层析一步纯化得到电泳纯的PDH,纯化倍数为2.94倍,活性回收率为50%,经SDS-PAGE电泳鉴定获得一条清晰条带,表达蛋白亚基相对分子质量约为41kDa.用改进的溶胶-凝胶法(杂化凝胶)包埋纯化酶,考察正硅酸乙酯(TEOS)浓度、海藻酸盐(ALG)浓度、CaCl2浓度及ALG与TEOS体积比等因素对酶固定化效果的影响,结果表明,较优包埋条件为:p(TEOS)=20g/L,p(ALG)=30g/L,p(CaCl2)=40g/L,V(ALG):V(TEOS)=3:1;由此制备的PDH的ALG-SiO2杂化凝胶保藏60天后酶活仍保持80%,进行批次反应时,反应3批后酶活保持7013%,反应第6批时酶活剩余29.8%.     

地衣芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的分离纯化

采用絮凝、超滤及离子交换对地衣芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶进行了分离纯化,纯化倍数为33倍,酶活收率达42%,所得纯化的β-甘露聚糖酶比活为4341 U/mg蛋白质.本文提出的分离纯化工艺易于工业放大.     

硫酸铵沉淀和层析法分离纯化纳豆激酶的研究

利用生产纳豆激酶的Bacillus subtilis进行深层发酵.采用发酵液离心除菌,20%～60%饱和度的硫酸铵沉淀,Superdex 75凝胶过滤层析和SP Sepharose Fast Flow离子交换层析对活性组分进行分离提纯.用纤维平版法测定了活力,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对分离纯化的效果进行了检验.结果表明在SDS-PAGE中观察到单一条带,分子量27.7 kD,最终纯化倍数和酶活回收率分别为8.4和49%.     

海洋细菌Vibrio natriegens琼胶酶的分离纯化及降解产物分析

从海洋细菌Vibrio natriegens HJPHYXJ-1发酵液中提取、分离纯化琼胶酶,研究其酶学性质并对降解产物进行分析。发酵液经离心、(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶过滤等纯化步骤得到SDS-PAGE电泳级纯酶。酶纯化倍数为14.36,回收率为4.4%,分子量约为33.8 k Da。琼胶酶的最适反应条件:温度为45℃,反应pH为8.5,底物浓度为0.5%;琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为12.24 mg/m L和0.051 mmol/(L·min),对琼胶底物具有高效专一性,经高效液相色谱法(HPLC)分析,当降解反应5 h时,酶解产物主要为分子聚合度2~12之间的新琼寡糖。     

高强度耐有机溶剂蛋白酶的纯化及性质

分离纯化了自行筛选的耐有机溶剂的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YP1所产的溶剂稳定性蛋白酶. 发酵液经硫酸铵沉淀、疏水层析及强阳离子交换层析纯化,得到电泳纯的蛋白酶;分子量约为28 kDa,纯化蛋白酶的比酶活达到1.18′105 U/mg,纯化倍数为37.2,酶活回收率为20.8%. 纯化的YP1蛋白酶对50%(j)的多种亲水或疏水有机溶剂具有很高的耐受性,其中50%(j)的DMF和DMSO能显著促进YP1蛋白酶活力. YP1蛋白酶为Zn2+蛋白酶,最适反应温度为55℃,最适反应pH为10.0,pH 8.0~13.0范围内具有高活力. 以酪蛋白为底物,YP1蛋白酶的米氏常数Km为0.048 g/L.     

固定化胃蛋白酶的工艺优化

利用海藻酸钠-壳聚糖对胃蛋白酶进行固定化,以酶活回收率为指标,探讨不同的氯化钙浓度、固定化时间、游离胃蛋白酶稀释倍数、海藻酸钠浓度对固定化胃蛋白酶效果的影响。采用响应面分析法进行固定化工艺优化。结果表明:海藻酸钠浓度最佳固定化浓度为0.9%,游离酶稀释倍数为10倍,氯化钙浓度为3.6%,固定化时间为1.5 h,该条件下固定化酶的酶活回收率为73.42%,连续反应5次,相对酶活力仍为61.20%。     

重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)衍生物的纯化及检定

采用热处理、盐析和离子交换层析技术对新型人肿瘤坏死因子α衍生物 (命名为hTNFD)蛋白进行了纯化 ,纯化后的纯度大于 96 % ,回收率为 43.8% ,纯化倍数为 6 .4倍。经L92 9细胞测活结果表明 ,hTNFD的比活可达 1.0 1× 10 1 0 U mg ,比原型TNFα活性提高 46 5倍 ,整个纯化工艺简单、稳定 ,易于放大 ,显示出较好的临床应用前景 ,     

用于农药残留测定的植物酯酶部分纯化的研究

确定了DEAE-纤维素(DE-52)部分纯化小麦酯酶粗酶的条件,绘出了该酶的洗脱图谱,找出了两个所需的酶活力峰,测定出其酶活力分别为8.2942 U、1.7214 U.算得酶的提纯倍数为2.817、回收率为35.18%.     

豆壳过氧化物酶的分离纯化新工艺研究

采用一种新的简单纯化工艺进行了过氧化物酶分离纯化实验研究。该工艺为酶液经硫酸铵-丙酮协同沉淀,丙酮分级沉淀,最后用硫酸锌除杂。使豆壳过氧化物酶的Rz达到1.32,总酶活收率为65%。使用了丙酮-硫酸铵协同沉淀法,即有机溶剂-无机盐二相系统,是一种简便有效的分离纯化生物大分子的新方法。     

纤维素酶法提取葶苈子多糖的工艺研究

优化纤维素酶法提取葶苈子多糖及其纯化。通过单因素实验和正交实验,研究酶解温度、提取时间、酶用量和pH值对葶苈子多糖提取率的影响,并经脱脂、热水抽提、乙醇沉淀、Sevage法脱蛋白得到葶苈子多糖。纤维素酶法提取的优化工艺条件为:pH值为5,加酶量4mL,酶解温度50℃,提取时间1h。在此条件下,葶苈子多糖的提取率平均为4.8%,RSD为0.12%。纤维素酶法提取葶苈子多糖省时高效,多糖的纯化方法简便,易操作,纯度高。     

酶-膜法提取纯化荔枝核中氨基酸

采用酶-膜法提取纯化荔枝核中氨基酸。使用X JT9503中性蛋白酶酶解辅助提取荔枝核中氨基酸,实验确定酶解的优化条件为:酶用量600 U/g、酶解温度50℃、pH=6.5、酶解时间90 m in,氨基酸得率为1.16%。采用水提法和酸解提取法氨基酸得率分别仅为0.41%和0.92%。实验表明,酶解提取法要优于水提法和酸解提取法。使用截留相对分子质量50 000的陶瓷超滤膜纯化酶解提取液,实验表明,膜通量随操作压力和料液温度升高而增加。在操作压力0.22 MPa,料液温度30℃的条件下,膜的平均通量为75.63 L/(m2.h),氨基酸的截留率仅为10.3%,蛋白质的截留率为98.1%,多糖的截留率为85.2%,氨基酸能够与蛋白质、多糖等大分子实现有效分离。     

1，3-丙二醇脱氢酶一步纯化与杂化凝胶固定化的初步研究

转录表达来源于Klebsiella．pl,3-丙二醇脱氢酶（PDH）基因片段的E．coli工程菌,在5L发酵罐、30℃、pH值7．0、200r／min（微氧）条件下培养20h;发酵菌体经破碎分离后所得样品通过HisTrap HP柱亲和层析一步纯化得到电泳纯的PDH,纯化倍数为2．94倍,活性回收率为50％,经SDS-PAGE电泳鉴定获得一条清晰条带,表达蛋白亚基相对分子质量约为41kDa。用改进的溶胶-凝胶法（杂化凝胶）包埋纯化酶,考察正硅酸乙酯（TEOS）浓度、海藻酸盐（ALG）浓度、CaCl2浓度及ALG与TEOS体积比等因素对酶固定化效果的影响,结果表明,较优包埋条件为：ρ（TEOS）=20g／L,ρ（ALG）=30g／L,ρ（CaCl2）40g／L,V（ALG）：V（TEOS）=3：1;由此制备的PDH的ALG-SiO2杂化凝胶保藏60天后酶活仍保持80％,进行批次反应时,反应3批后酶活保持70．3％,反应第6批时酶活剩余29.8％。     

Nocardia sp.腈水合酶的纯化过程研究

对Nocardiasp.高活力腈水合酶进行了纯化研究。在细胞破碎中,超声时间对腈水合酶比酶活存在一个最优值,超声时间为20.00min时得到的比酶活最高。在离子交换层析过程中,采用DEAE-Sepharose作为层析介质,分别对平衡缓冲液pH、离子强度和线性梯度洗脱体积进行了优化。结果表明,采用pH7.20、50mmolL-1的Na2HPO4-NaH2PO4溶液作为平衡缓冲液,0.00~1.00molL-1的NaCl线性梯度洗脱,洗脱体积为20~25倍柱体积,此条件下腈水合酶的纯化倍数和酶活收率较佳。以Phenyl-SepharoseFF为层析介质研究了疏水层析精制腈水合酶的工艺过程,采用两步层析优化方法纯化出的Nocardiasp.腈水合酶比酶活达到2648.0U穖g-1,酶活收率为40.84%,用SDS-PAGE检测其纯度为99.00%以上。Nocardiasp.腈水合酶的两个亚基分子量分别为22.90kDa和27.38kDa。     

豆类来源D-海因酶的提取及特性研究

首次对几种豆类来源的二氢嘧啶酶进行了提取和纯化,并对其D-海因酶酶活进行了测定,筛选出具有D-海因酶酶活的三种豆子,其中红小豆来源的D-海因酶酶活最高,对影响酶活的相关因素进行了研究。结果表明,在底物为0.8%的对羟基苯海因、pH值为8.0、反应温度为65℃的最佳酶促反应条件下,D-海因酶活力最高,达8.348U.mL-1。