壳聚糖层析凝胶洗脱条件优化

以壳聚糖为原料,经交联还原,制备了一种新型层析凝胶。为更好地应用该层析凝胶,对其洗脱条件进行了优化。确定了最佳洗脱体系是三羟甲基氨基甲烷(以下简称为tris HCl)溶液,体系的pH=9 05。考察了层析凝胶的颗粒度、洗脱液流速、离子强度、pH等条件对分离效果的影响,得到壳聚糖生物层析凝胶洗脱条件为:120～140μm壳聚糖层析凝胶装柱,用c(NaCl)=0 05mol/L的tris HCl(pH=9 05)洗脱,控制2 0～3 0mL/min流速。中性蛋白酶经壳聚糖层析凝胶一次层析,可分离得到4个组分,总酶活收率达90%以上,而用SepharoseCL-6B的对比实验只获得一个组分,酶活收率只有43 11%。     

聚合物纳米微球分离纯化染料木素的工艺条件优化

采用聚合物纳米微球分离纯化大豆中的染料木素,研究了聚合物纳米微球型号、洗脱液体积分数、洗脱速度、载样量（样品与填料的质量体积比,g∶mL,下同）对分离纯化效果的影响。确定最佳工艺如下：采用PS25-300型聚合物纳米微球作层析介质、洗脱液乙醇的体积分数为60%、洗脱速度为2BV.h-1、载样量为1∶200,在此条件下,层析收率大于75%、纯度大于98%。该工艺过程简单、易操作、产品收率高且质量可控,可用于高纯度染料木素的分离纯化。     

鸡白痢沙门氏菌兔抗血清多抗IgG的纯化与稳定

建立了离子交换层析介质一步纯化鸡白痢沙门氏菌兔抗血清获得多抗免疫球蛋白G (IgG)的方法，利用IgG与杂蛋白等电点的差异，指导阴阳离子交换层析介质筛选和操作条件优化；针对多抗IgG易失活的难题，采用差示扫描荧光法为纯化后的IgG筛选稳定剂。结果表明，通过毛细管等电聚焦测得兔抗血清多抗IgG的等电点为6.04?7.08，阳离子交换介质CM Sepharose Fast Flow层析纯化的IgG最高电泳纯度为63.5%，高效液相尺寸排阻色谱测得IgG回收率为15.5%；阴离子交换层析纯化效果更佳，pH 5.5条件下Q Sepharose XL(Q-XL)介质层析获得的IgG最高纯度达99.3%，回收率达67.5%；200 g/L山梨醇对IgG具有最佳稳定作用，IgG的2个热变性温度分别提高了5.52和8.84℃，70℃时山梨醇的稳定作用更明显；以200 g/L山梨醇为稳定剂、用阴离子交换层析介质Q Sepharose XL一步纯化所得IgG具有高纯度、高收率及高稳定性，且制备工艺简单。     

Candida sp.脂肪酶的纯化及其性质

采用简单的两步法-离子交换层析和疏水层析法,对Candida sp. 99-125脂肪酶进行了纯化,比活提高了10.0倍,达到27200 U/mg,回收率为35.5%. SDS-PAGE电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为40℃,最适反应pH值为8.5,在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80能够促进提高脂肪酶的活性,而铁离子、铜离子和SDS对其有明显的抑制作用.     

基于疫苗颗粒完整性的硅胶吸附/解吸附纯化重组乙肝表面抗原 工艺研究

针对重组汉逊酵母乙肝表面抗原(HBsAg)在传统纯化过程中稳定性差的问题，采用静态光散射、荧光光谱和动态光散射等分析手段，从颗粒完整性角度研究其在不同pH条件下的稳定性变化。以其为指导，采用硅胶吸附/解吸附纯化HBsAg，建立该过程中关键因素的响应面模型，并与疏水层析联用，进一步纯化HBsAg，分析纯化效果以及纯化后疫苗颗粒完整性。采用透射电镜观察纯化后疫苗形貌，用高效分子排阻色谱法(HPSEC)分析颗粒稳定性。结果表明在酸性溶液下，pH接近HBsAg等电点时，抗原颗粒间静电斥力减小，颗粒容易聚集；碱性条件下，抗原颗粒内部疏水基团暴露，造成颗粒解聚。建立响应面模型，以活性收率为响应值时，最佳纯化工艺为吸附pH=7.43，洗脱pH=10.48，洗脱温度55.4℃，此时活性收率最高为39.1%；以纯化倍数为响应值时，吸附pH=7.16，洗脱pH=10.52，洗脱温度55.1℃，此时纯化倍数最高为1.90。进一步对洗脱液进行疏水层析纯化，活性收率为49.73%，颗粒完整性为85.79%，透射电镜观察到抗原颗粒粒径为20~40 nm。与传统疏水层析方法相比，采用硅胶吸附/解吸附与疏水层析联用的纯化方法，疫苗活性收率提高31.99个百分点，颗粒完整性提高20.90个百分点，颗粒稳定性提高22.93个百分点。该研究为高效纯化重组HBsAg及提高疫苗纯化过程的颗粒完整程度等提供新思路。     

甲型肝炎病毒复合层析介质Capto Core 400的纯化效果

目的 探索新型复合层析介质Capto Core 400层析填料纯化甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的效果。方法用Capto Core 400层析介质纯化人胚肺二倍体细胞(2BS株)培养收获的HAV粗纯液,经流速(60、150、300、450 cm/h)、上样缓冲液pH(6.6、7.0、7.4)、上样缓冲液盐离子浓度(0、0.15、0.3、0.45 mol/L)、载量[0.5、1、2、4柱体积(column volume,CV)]筛选最适纯化HAV的条件,并与传统Sepharose 4FF层析介质纯化效果进行比较。结果 初步确定Capto Core 400纯化工艺条件为流速150 cm/h、上样缓冲液pH 7.0～7.4、盐离子浓度0.15 mol/L、上样量2 CV时,纯化效果最好,病毒回收率平均为92.61%,蛋白去除率平均为84.25%。Sepharose 4FF层析介质纯化HAV抗原回收率平均为76.03%,蛋白去除率平均为73.21%,Capto Core 400层析介质纯化效果优于Sepharose 4FF层析介质。结论Capto Core 400复...     

Rhodococcus boritolerans FW815腈水合酶分离纯化及其酶学性质研究

Rhodococcus boritolerans FW815具有高效水合2,2-二甲基环丙甲腈活性,利用蛋白质柱层析技术从中分离得到R.boritolerans FW815腈水合酶。实验结果表明,该腈水合酶分子量为40 kDa,由大小分别为24 kDa、22 kDa两种亚基构成。R.boritolerans FW815腈水合酶最适作用温度为37℃,最适作用pH值7.0。Cu2+、Zn2+、Ni2+等金属离子及EDTA对该腈水合酶有较强的抑制作用。除2,2-二甲基环丙甲腈、2-氨基-2,3-二甲基丁腈之外,R.boritolerans FW815腈水合酶对2-氧代-1-吡咯烷基丁腈、丙烯腈、2-氨基-4-甲硫基丁腈也表现出腈水合酶活性。     

阴离子交换层析法纯化聚唾液酸工艺

以大肠杆菌发酵所产聚唾液酸粗品(含蛋白质、核酸、无机盐和色素等杂质)为纯化对象,通过静态吸附和梯度洗脱实验选择了分离效果较好的阴离子交换介质Q-琼脂糖凝胶FF,对聚唾液酸的纯化工艺条件进行优化. 得到最佳洗脱条件为：洗脱液为pH 7.2的NaCl-0.02 mol/L磷酸钠缓冲液体系,流速0.8 mL/min,洗脱线性梯度方程为CNaCl=0.0017VEluent (CNaCl为NaCl浓度,VEluent为洗脱液体积),层析柱体积46 mL时最大进样量4.0 mL. 该条件下聚唾液酸回收率在86.0%以上,纯化后样品中的蛋白质含量从1.9%降低至0.04%,纯度在98%以上. 紫外吸收光谱和高效凝胶过滤色谱分析表明,聚唾液酸产品组分均一,重均分子量为303 kDa.     

Nocardia sp.RS合成腈水合酶过程及其高酶活的表达工艺

对Nocardia sp．RS合成腈水合酶的过程进行了分析，研究了菌体生长和酶活表达的相互关系、pH调控和葡萄糖消耗对产酶速率的影响．根据腈水合酶在发酵过程中的生成特性，设计开发了葡萄糖—Co^2 耦合补加工艺优化产酶过程，通过对产酶过程的优化，大大提高了腈水合酶的发酵水平，酶活达到了10195U／ml，比优化前提高了43．2倍．     

高强度耐有机溶剂蛋白酶的纯化及性质

分离纯化了自行筛选的耐有机溶剂的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YP1所产的溶剂稳定性蛋白酶. 发酵液经硫酸铵沉淀、疏水层析及强阳离子交换层析纯化,得到电泳纯的蛋白酶;分子量约为28 kDa,纯化蛋白酶的比酶活达到1.18′105 U/mg,纯化倍数为37.2,酶活回收率为20.8%. 纯化的YP1蛋白酶对50%(j)的多种亲水或疏水有机溶剂具有很高的耐受性,其中50%(j)的DMF和DMSO能显著促进YP1蛋白酶活力. YP1蛋白酶为Zn2+蛋白酶,最适反应温度为55℃,最适反应pH为10.0,pH 8.0~13.0范围内具有高活力. 以酪蛋白为底物,YP1蛋白酶的米氏常数Km为0.048 g/L.     

游离细胞腈水合酶催化丙烯腈水合反应的双稳态反应动力学

腈水合酶是能够催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺的一种重要的工业酶。本研究建立了游离细胞腈水合酶催化丙烯腈水合反应的双稳态反应动力学模型,关联了底物浓度、产物浓度和温度等主要因素对反应速率(表观酶活)的影响。在实验研究的基础上,通过麦夸特及全局最优化算法求解了动力学模型。结果表明,游离细胞腈水合酶催化的双稳态反应动力学模型是比较典型的产物抑制型,当产物浓度逐渐增大时,高浓度的产物将抑制腈水合酶的活性。当底物浓度10g·L-1时,由于底物加入反应体系时产生的局部瞬时高浓度,腈水合酶催化的丙烯腈水合反应的表观反应速率不随底物浓度变化。当底物浓度≥10g·L-1时,底物产物浓度对反应速率具有显著影响。温度对酶活的影响也十分显著,相同底物产物浓度下,28℃时的酶催化水合反应速率是15℃时的3.3倍。     

Preparation of cross-linked enzyme aggregates of nitrile hydratase ES-NHT-118 from E. coli by macromolecular cross-linking agent

Cross-linked enzymeaggregates (CLEAs) of nitrile hydratase (NHase) ES-NHT-118 fromEscherichia coli were prepared by usingammoniumsulfate as precipitating agent followed by cross-linkingwith dextran polyaldehyde for the first time. In this process, egg white was added as protein feeder for facilitating the formation of CLEAs. The optimal conditions of the immobilization process were determined. Michaelis constants (Km) of free NHase and NHase CLEAswere also determined. The NHase CLEAs exhibited increased stability at varied pH and temperature conditions compared to its free counterpart. When exposed to high concentrations of acrylamide, NHase CLEAs also exhibited effective catalytic activity.     

一株产腈水合酶菌株酶活高效表达条件的研究

以抚顺腈纶厂废水中筛选的一株Nocardia sp为出发菌株,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的体积浓度重复继代培养,得到1株酶活高效表达的Nocardia sp菌,酶活比出发菌株提高了15倍。确定了菌株培养的最优条件:葡萄糖(25 g/L),诱导剂脲(0.06 g/L)、Co2+(0.02 g/L)、丙烯酰胺(10%),反应条件pH(7)、温度(20℃),底物丙烯腈体积分数(<5%),产物丙烯酰胺的质量分数(<20%)。正交实验表明,反应温度和脲的加入量为反应过程中的显著因素。     

聚乙烯醇脱氢酶的分离纯化及其酶学性质

采用(NH4)2SO4分级沉淀及Q-Sepharose HP柱层析两步纯化,首次从可高效降解聚乙烯醇(PVA)的混合菌系发酵产物中分离纯化获得了纯蛋白聚乙烯醇脱氢酶(PVADH),并对其酶学性质进行了研究. 结果表明,PVADH分子量为134.3 kDa,最适作用温度为35℃,最适作用pH值为7.5;PVADH以仲醇为底物时酶活性普遍高于以其他醇类为底物时,PVADH与PVA反应产物中检测到羰基化合物,证实PVADH对PVA有降解作用.     

生物法生产丙烯酰胺过程中腈水合酶的抑制和失活

为改进生物法生产丙烯酰胺工艺,研究了腈水合酶催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺过程中影响腈水合酶反应速率和酶失活的因素. 实验证明,水合过程中体系pH值的变化基本不影响酶反应速率;底物丙烯腈的浓度低于10 g/L时,酶反应速率与底物浓度成正比,大于75 g/L后,对酶有抑制作用;产物丙烯酰胺显著抑制腈水合酶的活性;菌体细胞内可能存在可以稳定腈水合酶的物质,胞内的腈水合酶在40℃下的半衰期可以达到59.9 h;丙烯酰胺与温度的协同作用是腈水合酶失活的重要原因.     

极端条件驯化法提高腈水合酶产生菌的丙烯酰胺耐受性

为了提高产腈水合酶的菌体Nocardia sp.对催化产物丙烯酰胺的耐受性,利用极端条件改造了现有的丙烯酰胺生产菌株RS,通过向发酵液间歇加入丙烯腈催化生成丙烯酰胺,为菌体制造出一个极端环境,使菌体在生长催化过程中逐渐适应高浓度丙烯酰胺,强化其丙烯酰胺耐受性,驯化得到了RS-1菌株. 研究了驯化过程中菌体存活率、比死亡速率和腈水合酶活性随丙烯酰胺浓度的变化. 在不同的丙烯酰胺初始浓度(0~400 g/L)下比较了两菌株的丙烯酰胺耐受性,RS-1菌体催化丙烯腈水合的速率都大于RS菌体,平均提高30.8%;而且RS-1菌株的胞内腈水合酶也具有较好的丙烯酰胺耐受性. 在相同的水合条件下,RS-1菌株催化所得的丙烯酰胺终浓度和丙烯腈转化率分别为587.1 g/L和99.97%,都明显优于RS菌株的水合结果. 在进一步的水合实验中,RS-1菌株催化所得的丙烯酰胺终浓度达到了641.4 g/L.     

一种溶解酶(ATE)的分离纯化及其稳定性

An antithrombus enzyme (ATE) was precipitated by (NH4)2SO4 or ethanol from supernatant of Bacillus subtilis culture broth then purified using ion exchange chromatography on CM-sepharose fast flow. The effects of ionic strength and pH value on protein adsorption, the gradient elution at different flow rates and step elution were examined respectively. The recovery yield of the optimised process was 74.5% with a purification factor 8.1. The ATE molecular weight was estimated as 30ku by SDS-PAGE. The experimental results showed that the enzyme was stable in the range of pH 7 to pH11, and temperature 25℃ to 37℃.