N~＋注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究

应用低能氮离子（N＋）注入技术对纤维素酶产生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）进行诱变选育,在能量为10 keV,注量为150×10^14和200×10^14N＋/cm^2的条件下分别筛选得到3株纤维素酶高产菌株,连续5代遗传稳定性实验结果表明,所得到的高产菌株遗传稳定性较好,羧甲基纤维素酶活力均提高到3.300 IU/mL以上,较出发菌株（2.698 IU/mL）提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman实验设计法和旋转中心组合设计法系统地研究高产菌株150-1-1发酵营养因子组成,得到了纤维素酶产量随葡萄糖、麸皮和微晶纤维素等营养因子的变化规律及相应的响应面分析图。实验结果表明,葡萄糖、麸皮和微晶纤维素浓度与纤维素酶活存在显著的相关性,当葡萄糖浓度为4.9 g/L,麸皮浓度为23.0 g/L,微晶纤维素浓度为7.7 g/L时,150-1-1纤维素酶滤纸酶活力达到2.439 IU/mL,较优化前（2.000 IU/mL）提高了22.0%。     

N+注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究

应用低能氮离子（N⁺）注入技术对纤维素酶产生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）进行诱变选育,在能量为 10 keV,注量为150×10¹⁴和200×10¹⁴ N⁺/cm²的条件下分别筛选得到3株纤维素酶高产菌株,连续5代遗传稳定性实验结果表明,所得到的高产菌株遗传稳定性较好,羧甲基纤维素酶活力均提高到3.300 IU/mL 以上,较出发菌株 （2.698 IU/mL） 提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman实验设计法和旋转中心组合设计法系统地研究高产菌株 150-1-1 发酵营养因子组成,得到了纤维素酶产量随葡萄糖、麸皮和微晶纤维素等营养因子的变化规律及相应的响应面分析图。实验结果表明,葡萄糖、麸皮和微晶纤维素浓度与纤维素酶活存在显著的相关性,当葡萄糖浓度为4.9 g/L,麸皮浓度为23.0 g/L,微晶纤维素浓度为7.7 g/L时,150-1-1纤维素酶滤纸酶活力达到2.439 IU/mL,较优化前 （2.000 IU/mL） 提高了22.0%。     

生物催化肉桂醇制备3-苯丙醇

筛选到能催化肉桂醇生成3-苯丙醇的菌株CG10,该菌株被鉴定为毛霉菌(Mucor sp.)。对其进行生物催化研究,用气相色谱-质谱联用仪、红外光谱仪、高效液相色谱仪对产物进行了表征。通过对微生物催化反应条件的优化及对底物的耐受性实验得到最优降解条件为:糊精质量浓度为3g/L,蛋白胨质量浓度为1.6g/L,反应体系初始pH=5,肉桂醇的初始加入量为2mL/L,30℃下反应24h,二次加入量为0.5mL/L,反应8h,3次加入量为0.5mL/L,反应16h。在此条件下肉桂醇的转化率为99%,3-苯丙醇的选择性为92%,转化液中3-苯丙醇的产量较优化前提高了123%,达到2.9g/L。     

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的研究

植物纤维是自然界最丰富的资源,筛选高产纤维素酶菌株,降低纤维素酶的生产成本,让植物纤维变废为宝一直是研究热点。从腐烂植物叶片中分离到一株高产纤维酶菌株CXYJ-1。对CXYJ-1菌株进行发酵培养条件的研究,结果表明,以豆饼粉为碳源,(NH_4)_2SO_4为氮源,培养温度为35～37℃,初始pH=5,培养96 h,产酶活力最高,CMC酶活为4.8 U/mL,FP酶活为4.5 IU/mL。     

两相体系中生物转化肉桂醇生成天然2-苯乙醇

利用肉桂内生菌鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. Z45生物转化肉桂醇合成天然2-苯乙醇（2-PE），为了提高肉桂醇的转化率和产物2-PE的浓度，探究了在有机溶剂/水两相体系中进行生物转化的工艺条件。选择确定了油酸作为构建两相体系的有机相，在初始pH=7的10 mL发酵培养基中，加入1 mL种子液培养24 h后，同时加入底物肉桂醇3 g/L，油酸10 mL，在30℃、转速为200 r/min的摇床反应12 h，在此条件下肉桂醇转化率达88%，2-苯乙醇浓度为2.64 g/L。与单水相体系同等条件下（底物肉桂醇加入量3.0 g/L）的转化结果相比较，肉桂醇转化率提高了88%，2-苯乙醇的浓度提高了120%。     

一株 Bacillus sp.催化水解苯乙二醇硫酸酯研究

Bacillus sp.CCZU11-1可催化外消旋苯乙二醇硫酸酯合成（ S）-苯乙二醇（＞99％e.e.）。经优化,最适反应介质为正辛烷-缓冲溶液（20：80, V/V）两相体系,最适反应条件：温度30℃, pH 7.0,金属离子添加剂Fe2＋（0.1 mM）,细胞浓度0.10 g（湿重）/mL。生物转化50 mM 外消旋底物24 h,（ S）-苯乙二醇（＞99％e.e.）产率为48.7％。分批补料8批反应,可获得累计浓度达185 mM的（ S）-苯乙二醇。     

红球菌CCZU10-1选择性氧化拆分外消旋苯甲亚砜的性能

为了高效地合成高光学纯手性亚砜,在单水相体系中利用Rhodococcus sp. CCZU10-1选择性氧化拆分外消旋苯甲亚砜（rac-PMSO）合成了(S)-PMSO（ee>99.9%）。通过考察反应pH值、反应温度、摇床转速、辅助底物、生物催化剂添加量对催化反应的影响,确定了最适反应条件。结果表明最适反应条件为：反应pH值8.0、反应温度30℃、摇床转速180r/min、辅助底物为半乳糖（50mmol/L）、细胞浓度为0.08g(湿重)/mL。在最适反应条件下生物转化20mmol/L rac-PMSO时,(R)-PMSO完全转化,(S)-PMSO（ee>99.9%）产率为47.1%。因此,研究结果为工业化生产(S)-PMSO奠定了基础。     

产纤维素酶增效蛋白菌株的筛选及培养条件优化

为了寻找高效的产纤维素酶增效蛋白菌株,建立一种筛选方法从土壤中筛选得到一株产纤维素酶增效蛋白的细菌POEP1,其所产增效蛋白对纤维素酶(来源于黑曲霉Aspergillus niger)的滤纸酶活有明显的增效作用,通过对其进行16SrDNA分类鉴定,确定该菌株为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)。为进一步提高POEP1产纤维素酶增效蛋白的水平,对其培养条件进行优化。采用单因子试验筛选出最佳碳源为麦麸,最佳氮源为黄豆粉。再通过Plackett-Burman设计对与发酵相关的11个因子进行试验,筛选出麦麸、黄豆粉和KH2PO4为3个主要显著因子;由Box-Behnken实验结合响应面分析确定主要因子的最优水平为:麦麸质量浓度32.3 g L 1,黄豆粉质量浓度24.7 g L 1,KH2PO4质量浓度4.36 g L 1。优化后纤维素酶增效蛋白的产量提高1.7倍,增效活力由15.79 U mL 1增至43.31 U mL 1。     

肉桂叶生物转化制备肉桂醇

从土壤中筛选到的微生物菌株MX18具有降解肉桂叶的能力,其转化产物通过气相色谱-质谱联用仪鉴定为肉桂醇。该菌株被鉴定为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.),命名为Sphingomonas sp.MX18,并用于生物转化肉桂叶合成天然肉桂醇的反应,考察发酵培养基碳源、氮源、反应体系初始p H值、温度、底物加入量、转化时间对转化反应的影响。结果表明,反应优化工艺条件为:糊精为碳源,质量浓度30 g/L,蛋白胨为氮源,质量浓度20 g/L,初始p H值5,肉桂叶粉的加入量10 g/L,30℃下反应72 h。在此条件下,肉桂醇的得率达0.77%。     

肉桂叶生物转化制备肉桂醇

从土壤中筛选到的微生物菌株MX18具有降解肉桂叶的能力,其转化产物通过气相色谱-质谱联用仪鉴定为肉桂醇。该菌株被鉴定为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.),命名为Sphingomonas sp.MX18,并用于生物转化肉桂叶合成天然肉桂醇的反应,考察发酵培养基碳源、氮源、反应体系初始p H值、温度、底物加入量、转化时间对转化反应的影响。结果表明,反应优化工艺条件为:糊精为碳源,质量浓度30 g/L,蛋白胨为氮源,质量浓度20 g/L,初始p H值5,肉桂叶粉的加入量10 g/L,30℃下反应72 h。在此条件下,肉桂醇的得率达0.77%。     

直接降解木质素的漆酶/木聚糖酶体系的合成

对一株高产漆酶及伴有木聚糖酶和少量纤维素酶的菌株,用不同的碳源和氮源对其调控培养,合成漆酶/木聚糖酶体系。实验结果表明,最佳的碳源是可溶性淀粉,用它作碳源,漆酶活性高达730IU/mL,木聚糖酶活性是4.49IU/mL,纤维素酶活性只有0.23IU/mL;最佳的氮源是蛋白胨,用其作氮源,合成漆酶活性可达812IU/mL,木聚糖酶活性是4.68IU/mL,纤维素酶活只有0.09IU/mL。     

产木聚糖酶优良菌株的选育

对荧光假单孢杆菌野生株（Pseudomonasflu）0－01进行紫外（UV）诱变和化学诱变后,得诱变株0-96,其在自落形态上稍有改变,产酶能力得到显著提高,本聚糖酶活可达325．45IU／mL,而纤维素酶的含量却比较低,只有0．5IU／mL左右。该菌株可用廉价的农副产品作为培养基,而获得较高的防产量。     

海洋微生物溶菌酶的发酵优化与中试生产

以海洋细菌S-12-86为试验菌株,采用摇瓶发酵优化的方式,研究培养基组分(碳源、氮源、碳源与氮源的比例、金属离子)与发酵条件(培养温度、接种体积分数、装液体积分数、起始pH值、产酶周期)对海洋微生物溶菌酶产量的影响,并进行中试放大试验。结果表明:该菌产酶最佳培养基组分为:葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L,MgSO45 g/L,CaCl22 g/L;最适发酵培养温度为30℃,接种体积分数为4.0%,装液体积分数为10.0%,起始pH值为8.0,发酵周期24 h。海洋细菌S-12-86发酵优化后的产酶量(25636.8 U/mL)较优化前的产酶量(14454.4 U/mL)提高了75.4%。海洋微生物溶菌酶中试发酵的产酶量达26697.87 U/mL。说明摇瓶发酵优化条件可以应用于海洋微生物溶菌酶中试生产上。     

氮源对里氏木酶合成木聚糖酶的影响

分别以（ＮＨ４）２ＳＯ４、酵母浸膏及蛋白胨为产酶氮源制备木聚糖酶。试验结果表明,酵母浸膏的产酶效果最好,其次是（ＮＨ４）２ＳＯ４。当以酵母浸膏为氮源产酶时,酶活力最高达到２５．４７ＩＵ／ｍＬ,酶得率和酶产率分别为３６３８．６ＩＵ／ｇ木聚糖和８４９０．０ＩＵ／Ｌ·ｄ,酶活力分别是以（ＮＨ４）２ＳＯ４及蛋白胨为氮源时的１．５倍和２．０倍     

木聚糖成分对木聚糖酶合成的影响

分别以两种含有不同组成的木聚糖为碳原进行产酶研究,结果发现木聚精成分对里氏木霉产木聚糖酶的效果具有重大影响。实验结果表明,用全组分的木聚糖（即用酒精等有机溶剂沉淀下来的木聚糖）诱导合成本聚糖酶的效果要比仅以水不溶性高聚合度木聚糖的效果好。当以全组分的木聚糖为碳源产酶时,不仅产酶周期缩短（仅需2．5d）,而且有利于提高木聚糖酶活力,酶活力、比活力、酶得率及酶产率分别达到34．27IU／mL、78．21;IU／g蛋白质、4895．7IU／g木聚糖和13708．0IU／L·d,酶活力和酶产率分别是以水不溶性木聚糖为碳源时的2．7倍和3．3倍。     

黄曲霉YZC产纤维素酶的固态发酵条件优化

为了提高黄曲霉YZC固态发酵所产纤维素酶的酶活力,采用单因素试验分别研究了碳源、氮源、氮源质量浓度、培养温度、培养时间、初始p H值、接种量对纤维素酶酶活的影响。优化后的固态发酵条件为：碳源为质量比3∶2的稻草粉与麸皮,氮源为NH4Cl,其质量浓度为10 g/L,培养温度为30℃,培养时间为7 d,初始p H值为4.0,接种量为20%。在此基础上,采用响应曲面法对影响纤维素酶活的3个因素包括氮源NH4Cl的质量浓度、培养时间、初始p H值进行优化,以期提高纤维素酶酶活。通过响应曲面分析得到滤纸酶活力与这三个因素的最优回归方程,确定滤纸酶活力最大时的最佳组合为NH4Cl质量浓度为8.5 g/L、培养时间为6.5 d、初始p H值为4.5,该条件下滤纸酶活力为10.87 IU/m L,是优化前的2.39倍,并与响应曲面拟合所得方程的预测值10.50 IU/m L符合良好。     

一株脂肪酶产生菌及其脂肪酶催化性质的初步研究

从各种含油脂的土壤中筛选分离到一株高选择性拆分(R,S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R,S)-HPBE]的产脂肪酶菌株CF-12,经形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析,鉴定该菌为沙雷氏菌属（Serratia sp.）。对菌株CF-12产脂肪酶的发酵条件进行了初步优化,确定最适产酶条件为：蔗糖5 g/L,酵母粉10 g/L,金属离子Mg²⁺ 0.75 mmol/L,发酵培养24 h,脂肪酶活性可达20.1 U/mL。该脂肪酶最适反应温度和pH值分别为40 ℃和7.0。利用冻干酶粉拆分 (R,S)-HPBE 15 h,(R)-HPBE产率达39.6%,ee=90.8%。