解糖热纤维菌木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过生物信息学分析,确定厌氧孢子菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus编码的木糖苷酶(XYL39B)属于糖苷水解酶第2家族,是极端耐热的水解低聚木糖为木糖的关键酶。将XYL39B基因(xyl39B)导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过热处理和镍柱亲和层析获得纯酶。对纯化的重组XYL39B进行酶学性质的表征,结果表明该酶的最适反应温度为70℃,最适反应p H为6.0。在p H 6.0,70℃条件下保温2h后残留相对酶活仍达90%以上,在55~75℃范围内酶活较高且比较稳定。Zn2+、Cu2+、SDS对酶活力的抑制作用较明显,其他金属离子和化学试剂对该酶的酶活力影响不显著。在以4-对硝基苯酚-β-D-木糖苷(p NPX)为底物,该酶的表观活化能为14.52k J/mol,其Km值为11.47mmol/L,Vmax为29.4U/g,Kcat为20.60s–1,木糖对其反馈抑制较弱(抑制常数Ki为306.87mmol/L),综上结果显示该酶是活性较高且抑耐木糖抑制的细菌源极端耐热木糖苷酶。研究结果为其后续的基因改造和实际应用奠定理论基础。     

葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及一步纯化

从绿色木霉中克隆了葡萄糖苷酶bg基因,构建入表达载体pPIC9k-His6中,然后在AOX1启动子的控制下,在毕赤酵母GS115菌株中表达. 在5 L发酵罐中发酵120 h,重组P. pastoris Mut+菌株湿重达360.6 g/L,葡萄糖苷酶浓度和酶活分别为2.1 mg/mL和73.5 U/mL. 经亲和层析一步纯化后,得到了电泳纯的葡萄糖苷酶. HPLC分析显示其纯度为95.6%,比酶活为71.9 U/mg. 纯化过程酶得率为73.6%,纯化倍数为42.6. 纯酶的等电点为5.0,最适温度为50℃,最适pH为6.5. 金属离子Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe2+及SDS对葡萄糖苷酶活性有抑制作用,而Mg2+, Mn2+, K+能增强葡萄糖苷酶活性,其中1 mol/L Mg2+能使酶活提高20%.     

A型肉毒毒素轻链蛋白的表达及纯化

目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE3),分别于37、30、25℃IPTG诱导表达,表达产物经Chelating Sepharose 4Fast Flow(Cu~(2+))层析柱纯化,纯化产物经尿素梯度复性。结果质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL经酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,主要以包涵体形式存在,37℃诱导表达量最高,占菌体沉淀总蛋白的41%;包涵体经2%Trition-X100和2 mol/L尿素洗涤后,可去除部分杂蛋白,8 mol/L尿素能溶解大部分包涵体;经再次浓缩后,蛋白浓度可达89μg/ml,纯度达90%。结论成功克隆及表达了Bo NT/A轻链基因,为制备抗Bo NT/A轻链单链抗体以及研究肉毒中毒机制和治疗方案奠定了基础。     

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因的异源表达及纯化

将去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上,实现重组质粒pET-amyd在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达.经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析,重组酶AMYD的比活达到354.6 U·mg-1、纯化倍数为83.83,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,AMYD酶分子量为63.5 kDa.重组酶AMYD的最适温度80℃、最适反应pH值为4.5,在温度低于90℃、反应pH值4.0～6.5的条件下,酶活较稳定.     

巴斯德梭菌甘油脱水酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质的研究

用聚合酶链反应(PCR)技术,从巴斯德梭菌(C lostridium pasteurianum)扩增出甘油脱水酶基因(dhaBCE),在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳结果显示,分别有相对分子质量为66、21、16 kD三条特异性蛋白表达条带。用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,所得纯酶的比活为4.26 U/mg。重组酶的最适反应温度42~44℃,最适作用pH=9.10~9.50,它对三个底物结构类似物的米氏常数(Km)值分别是:1,2-丙二醇0.38 mmol/L,甘油0.29 mmol/L,1,2-乙二醇2.0 mmol/L;对辅酶B12的Km值为0.22μmol/L。     

重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。     

重组表达天冬氨酸-β-脱羧酶及其酶学性质

利用p ETDuet-1为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)来源的天冬氨酸-β-脱羧酶(Asd),研究了其酶学性质,考察了p H、p H稳定性、温度、热稳定性、底物浓度对酶活的影响。结果表明,天冬氨酸-β-脱羧酶重组表达成功;最适反应温度和p H分别为45℃和6.0;动力学常数Km和Vmax分别为0.72 mmol/L和10.52 mol/(L·min·g)。0.1 g菌体细胞在10 m L 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液中催化2.0 g L-天冬氨酸,40℃,p H=6.0反应15 h,L-天冬氨酸的摩尔转化率达到98.6%。     

灰树花漆酶的酶学性质及其脱色作用研究

通过对液体发酵灰树花漆酶的酶活、Km常数、温度和p H值的测定,探讨了Cu2+、Fe3+、Ca2+对漆酶酶活的影响,观察了漆酶对5种染料的脱色作用效果。结果表明:灰树花发酵液中漆酶氧化ABTS的Km为1.35×10-5mol·L-1,在p H值2~6的范围内均表现酶活,最适p H值为3.0,在25~70℃温度时范围内均有酶活,在50~55℃时酶活性最高。Cu2+、Fe3+、Ca2+对漆酶的活性均有抑制作用,Ca2+离子的抑制作用较弱。灰树花漆酶对甲基橙、甲基红、溴甲酚绿、甲基蓝和亚甲基蓝染料的脱色率分别为85.77%,81.10%,72.68%,22.02%和4.22%。介体ABTS对漆酶处理甲基蓝的脱色有促进效果,而对亚甲基蓝、溴甲酚绿和甲基红的脱色促进效果较弱,对甲基橙的脱色无促进作用。结论:本研究中灰树花漆酶最适p H值为3.0,在50~55℃时酶活性最高;灰树花漆酶对甲基橙、甲基红、溴甲酚绿染料的脱色效果理想。     

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及其纯化

目的原核表达并纯化重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2),并初步确定其保存条件。方法将重组表达菌pCold TF-LP-PLA2-BL21(DE3)和pET28-HRV 3C-BL21(DE3)分别经IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后,经Ni-Sepharose 6FF金属螯合层析粗提重组蛋白,经HRV 3C蛋白酶酶切去除融合标签后,用Blue Sepharose誖6 Fast Flow(蓝胶)染料亲和层析及HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR分子筛进行分离纯化;通过人LP-PLA2临床检测金标准ELISA试剂盒验证重组蛋白;将重组LP-PLA2置于含10 mmol/L CHAPS和0.5 mmol/L PMSF的PBS溶液中,分别于4℃、室温、37℃保存1周以及-20、-80℃冻存4个月后,确立重组蛋白的保存条件。结果重组LP-PLA2相对分子质量约100 000,以可溶性形式表达,包涵体无表达;纯化后的重组LP-PLA2蛋白含量为3.68 mg/ml,蛋白回收率为21%,纯度可达95%,可被ELISA试剂盒识别,且具有良好的线性关系(R2=0.996 4);重组LP-PLA2于4℃保存1周,-20、-80℃冻存4个月,均无降解现象。结论成功表达、纯化了重组LP-PLA2,并初步确定了其保存条件。     

1,3-丙二醇脱氢酶-步纯化与杂化凝胶固定化的初步研究

转录表达来源于Klebsiella.pl,3-丙二醇脱氢酶(PDH)基因片段的E.coli工程菌,在5L发酵罐、30℃、pH值7.0、200r/min(微氧)条件下培养20h;发酵菌体经破碎分离后所得样品通过HisTrap HP柱亲和层析一步纯化得到电泳纯的PDH,纯化倍数为2.94倍,活性回收率为50%,经SDS-PAGE电泳鉴定获得一条清晰条带,表达蛋白亚基相对分子质量约为41kDa.用改进的溶胶-凝胶法(杂化凝胶)包埋纯化酶,考察正硅酸乙酯(TEOS)浓度、海藻酸盐(ALG)浓度、CaCl2浓度及ALG与TEOS体积比等因素对酶固定化效果的影响,结果表明,较优包埋条件为:p(TEOS)=20g/L,p(ALG)=30g/L,p(CaCl2)=40g/L,V(ALG):V(TEOS)=3:1;由此制备的PDH的ALG-SiO2杂化凝胶保藏60天后酶活仍保持80%,进行批次反应时,反应3批后酶活保持7013%,反应第6批时酶活剩余29.8%.     

Many Drugs of Abuse May Be Acutely Transformed to Dopamine,Norepinephrine and Epinephrine In Vivo

It is well established that a wide range of drugs of abuse acutely boost the signaling of the sympathetic nervous system and the hypothalamic–pituitary–adrenal (HPA) axis, where norepinephrine and epinephrine are major output molecules. This stimulatory effect is accompanied by such symptoms as elevated heart rate and blood pressure, more rapid breathing, increased body temperature and sweating, and pupillary dilation, as well as the intoxicating or euphoric subjective properties of the drug. While many drugs of abuse are thought to achieve their intoxicating effects by modulating the monoaminergic neurotransmitter systems (i.e., serotonin, norepinephrine, dopamine) by binding to these receptors or otherwise affecting their synaptic signaling, this paper puts forth the hypothesis that many of these drugs are actually acutely converted to catecholamines (dopamine, norepinephrine, epinephrine) in vivo, in addition to transformation to their known metabolites. In this manner, a range of stimulants, opioids, and psychedelics (as well as alcohol) may partially achieve their intoxicating properties, as well as side effects, due to this putative transformation to catecholamines. If this hypothesis is correct, it would alter our understanding of the basic biosynthetic pathways for generating these important signaling molecules, while also modifying our view of the neural substrates underlying substance abuse and dependence, including psychological stress-induced relapse. Importantly, there is a direct way to test the overarching hypothesis: administer (either centrally or peripherally) stable isotope versions of these drugs to model organisms such as rodents (or even to humans) and then use liquid chromatography-mass spectrometry to determine if the labeled drug is converted to labeled catecholamines in brain, blood plasma, or urine samples.     

ICP-MS法测定地球化学样品中As、Cr、Ge、V等18种微量痕量元素的研究

建立了测定地球化学样品中包括As、Cr、Ge、V等18种微量、痕量元素的ICP-MS方法。地化试样用HF-HNO3混酸分解后,以1 1 HNO3溶解干渣。由于制样不使用盐酸,避免了Cl对As、Cr、Ge、V的质谱干扰。用国家一级地球化学标准物质GBW 07309制备溶液优化仪器工作参数,并用于校准。方法测定限(6s)为:0.007~6.4μg/g,精密度(RSD%,n=12)为:29%~9.4%,经过国家一级地球化学标准物质的分析验证,结果与标准值吻合。方法已应用于国土资源调查的试样分析。     

基于ATRP法制备的触角状亲水性羟胺树脂的吸硼性能的研究

以大分子引发剂氯乙酰化聚苯乙烯微球(PS-acyl-Cl)经原子转移自由基聚合(ATRP)法引发丙烯酰胺(AM)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体的共聚接枝,制得一种触角状亲水性环氧载体(PS-acyl-g-P(AM-co-GMA)),再经二乙醇胺(DEA)的环氧基开环胺化反应,得到一种含多个-NCH2CH2OH螯合配基的多齿-五元螯合环的触角状亲水性羟胺树脂(PS-acyl-g-P(AM-co-GMA)-DEA)。将此树脂用于硼吸附研究,结果表明,PS-acyl-g-P(AM-co-GMA)-DEA树脂对硼的吸附满足Langmuir方程,为单分子层吸附;饱和吸附量约为37.7 mg·g-1,且树脂5 min即可达到吸附平衡,与其它已报道的吸硼树脂相比,该树脂具有更高的吸附量和吸硼速率。吸附动力学研究表明,树脂吸附硼的过程主要由颗粒扩散过程控制。重复使用5次后该树脂的吸附量基本不变,解吸率均在90%以上,重复使用性能良好。     

工业评述2001～2002年国外塑料工业进展

收集了2001年7月到2002年6月有关国外塑料工业的相关期刊资料,介绍了2001年到2002年国外塑料工业的发展情况,提供了世界各地域塑料原材料的产量及构成比,日本、美国、加拿大、德国、法国、比利时、墨西哥、芬兰、西班牙等国家的树脂产量、消费量及增长率,以及日本、西欧、北美等地区的不同品种塑料原料消费量和增长率统计.按通用热塑性树脂(聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、ABS树脂)、工程塑料(尼龙、聚碳酸酯、聚甲醛、热塑性聚酯、聚苯醚)、通用热固性树脂(酚醛、聚氨酯、不饱和树脂、环氧树脂)、特种工程塑料(聚苯硫醚、液晶聚合物、聚醚醚酮)不同品种的顺序,对树脂的产量、消费量及合成工艺、产品应用开发、树脂品种的延伸及应用的进一步扩展等有关技术作了详细的介绍.     

工业生产中物位测量的探讨与研究

在工业生产中常常会遇到常温,常压和一般介质的液位,料位和界面的测量,也会遇到高温,高压,易燃易爆,腐蚀性较强的液位,料位和界面的测量。在工业生产中物位测量有接触式和非接触式测量。但应根据生产工况及技术要求来合理选用。     

Confocal microscope—A valuable tool for examining wood-coating interface

The suitability of confocal laser scanning microscopy (CLSM) in examining a wood-coating interface was evaluated using a clear coating system. A comparison of the images of the wood-clear coating interface obtained using CLSM and light microscopy (LM) showed a marked superiority of CLSM in revealing the details of the physical nature of the interaction between the clear coating and the wood cell walls in the surface layer. The most distinct advantage of CLSM was in its ability to clearly resolve penetration of the coating into very fine cracks in cell walls, details not obtainable with LM. The information presented here demonstrates that CLSM has the potential to greatly enhance our understanding of the physical aspects of an interaction between the wood and coating at the interface.     

不同结构充油溶聚丁苯橡胶/炭黑/白炭黑复合材料的结构与性能

研究了炭黑/白炭黑填充的苯乙烯/乙烯基含量不同的充油溶聚丁苯橡胶(HPR 757 D和Buna VSL 5025-2 HM)的物理机械性能及动态力学性能,观察了填料在硫化胶中的微观分布情况。结果表明,炭黑与白炭黑相互镶嵌地分布在橡胶基质中,形成交织的填料网络。高苯乙烯基含量的HPR 757 D的拉伸强度、撕裂强度及耐磨性能优异,滚动阻力较小,填料与橡胶间的结合力强,填料的分散性较好。用白炭黑等量取代炭黑可以提高胶料的拉伸强度,降低其动态压缩温升。但炭黑/白炭黑的最佳配比与橡胶基质的分子结构有关,主链双键含量越高,白炭黑的用量也随之增多。