沪191麻疹病毒疫苗株连续传代的基因稳定性

目的研究沪191麻疹病毒疫苗株(S191)在原代鸡胚成纤维细胞中连续传代的基因稳定性,为评估和控制麻疹疫苗的免疫原性及安全性提供依据。方法取S191的22代冻干主种子批在SPF原代鸡胚成纤维细胞上连续传代获得的23、26(用于生产的疫苗代次)、29、31和33代病毒液,提取病毒RNA,RT-PCR扩增后,进行全序列测定,并对病毒关键的保护性抗原进行核苷酸和氨基酸序列分析。结果与22代全基因比较,核苷酸序列同源性:26代为99.96%,33代为99.92%;氨基酸序列同源性:26代为99.98%,33代为99.89%。26代疫苗病毒仅M蛋白第123位氨基酸由苏氨酸→赖氨酸,33代病毒有5个氨基酸差异。结论 26代S191麻疹疫苗疫苗病毒的基因结构高度稳定,疫苗可保持主种子病毒的免疫原性和安全性。     

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6~7 d,病毒滴度稳定在5.5~6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4~D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(Gen Bank登录号:EF033071)比对结果显示,D4~D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。     

不同代次S191株麻疹病毒的基因序列分析

目的分析不同代次S191纯化株麻疹病毒(MV)的主要蛋白基因序列。方法将S191纯化株MV在原代鸡胚细胞(CEC)上连续传4代,观察每代病毒培养特性。选择其中的CEC28、30和31代病毒,测定主要蛋白N、M、F和H基因序列,并与GenBank中标准株S191(1994)和S191(2008)序列进行比对。结果S191纯化株病毒在CEC上连续传4代,其培养特性、致细胞病变效应(CPE)及病毒滴度均基本稳定。S191株病毒CEC各代与S191(1994)株比较,在15个核苷酸位点上有区别,其中N蛋白基因6个、M蛋白基因3个、H蛋白基因1个核苷酸的差异对其编码的氨基酸产生了影响;与S191(2008)株比较,在2个核苷酸位点上有区别,且均导致氨基酸的改变。各代之间主要蛋白基因未见突变。结论S191纯化株病毒在《中国药典》三部(2005版)规定的代次范围内比较稳定,在CEC30代内均可作为工作代毒种使用。     

麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株的遗传稳定性

目的分析麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株病毒结构基因的遗传稳定性。方法将北京天坛生物制品股份有限公司(天坛生物)用于麻疹疫苗生产的S191株25代病毒(S191-BJ25)传至29代(S191-BJ29),上海生物制品研究所保存的S191株24代病毒(S191-SH24)传至33代(S191-SH33)。从S191株传代病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段N、M、F、H进行扩增及测序。将测序结果与GenBank中1994年收录的S191株麻疹病毒的相应序列进行比较分析。结果S191-BJ25传代病毒N、M、F、H4个基因的总突变率为0.02%,S191-SH24传代病毒为0.15%;与1994年的S191疫苗株相比,S191-BJ25传代病毒N、M、F、H4个基因的总突变率为0.3%,S191-SH24传代病毒为0.4%。结论目前天坛生物使用的麻疹疫苗S191株生产用三级种子库具有可靠的遗传稳定性,从主代种子到疫苗的传代过程中,N、M、F、H结构基因表现出稳定的分子遗传特征。目前使用的S191毒株的4个结构基因较1994年以前的疫苗株发生了变化,但目前没有证据表明这些变化对免疫原性产生不利影响。     

不同代次S191株麻疹病毒HA基因的序列分析

目的　考察麻疹S191疫苗株在长期传代过程中HA基因的变化 ,以确定用于生产的最佳代次。方法　对麻疹S191疫苗株鸡胚细胞系 (CEC) 2 0、30代病毒株及S191株羊膜系病毒株 (强毒 )HAM42的血凝蛋白 (HA)基因进行RT—PCR ,克隆到PUC质粒后进行测序。结果　 2 0代和 30代疫苗的HA基因的 185 4个碱基序列中未出现核苷酸的变化 ,但二者与HAM42株相比有两个核苷酸的变化 ,分别在 15 17和 1799位 ,并导致 5 0 6位的Gly变为Asp ,6 0 0位的氨基酸由Glu变为Val。结论　麻疹病毒的减毒株与强毒株存在差异。而麻疹减毒株在鸡胚细胞的长期传代中 ,HA基因未出现明显变化 ,没有出现抗原漂移 ,30代毒株与 2 0代毒株是一致的     

H2株甲肝病毒经KMBl7细胞培养的毒力及核苷酸序列

目的监测H2株甲肝病毒经人胚肺二倍体细胞KMB17培养的毒力／减毒水平及核苷酸序列。方法H2株甲肝减毒活疫苗H2M20K7(K7)用KMB17细胞增殖,分别在35℃和37℃连续传代后,抽查不同代次病毒的普通狨猴接种反应和核苷酸片段序列。结果H2-KMBl7系统在35℃培育16代次过程中,病毒的抗原滴度和感染性滴度稳定,在37℃的滴度明显低下,经13代次仍未达亲本水平。K18(35℃,11代)和K15(37℃,8代)病毒经普通狨猴接种反应证实为减毒性质。核苷酸两片段共1897个碱基的序列分析显示,K18和K15与K7的同源性高达99.3％～100％。结论K7疫苗病毒在KMBl7细胞培养经35℃和37℃连续传代,无毒力回升和遗传稳定性改变。     

流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84六代次基因序列分析

目的分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较。方法WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基因及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树。结果WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定。与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化。7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%。2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%。结论WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向。WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性及基因序列差异位点分析

目的研究水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性,并对不同代次毒株进行全基因测序及差异位点分析。方法将VZV Oka株在SV-1细胞株上连续传至48代,检测病毒滴度。对VZV Oka株33、35、38、39及48代病毒进行全基因测序,应用DNASTAR.Lasergene.v 7.1软件进行数据的拼接及序列分析。结果 VZV Oka株在SV-1细胞上连续传代获得的33~48代病毒滴度在4.000~4.625 lg CCID50/ml之间,病毒滴度的算数平均值为4.292 lg CCID50/ml;VZV Oka株基因组全长125 114 bp,GC含量46%;33、35、38、39、48代病毒的核苷酸序列同源性为99.99%,这5代病毒与标准疫苗株V-Oka的核苷酸序列同源性为99.96%;VZV Oka株在MRC-5、SV-1细胞上制备的38代病毒全基因序列有1个差异位点;本研究中的各代次病毒基因序列高度同源,与Varivax和Varilrix疫苗株、野毒株Dumas及亲本株p-Oka相比,与疫苗株V-Oka的同源性最高。结论 VZV Oka株在SV-1细胞上的适应性及遗传稳定性均良好。     

H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列

目的　监测H2株甲肝病毒经人胚肺二倍体细胞KMB17培养的毒力 /减毒水平及核苷酸序列。方法H2株甲肝减毒活疫苗H2M2 0K7(K7)用KMB17细胞增殖 ,分别在 35℃和 37℃连续传代后 ,抽查不同代次病毒的普通狨猴接种反应和核苷酸片段序列。结果　H2 KMB17系统在 35℃培育 16代次过程中 ,病毒的抗原滴度和感染性滴度稳定 ,在 37℃的滴度明显低下 ,经 13代次仍未达亲本水平。K18(35℃ ,11代 )和K15 (37℃ ,8代 )病毒经普通狨猴接种反应证实为减毒性质。核苷酸两片段共 1897个碱基的序列分析显示 ,K18和K15与K7的同源性高达 99 3%～ 10 0 %。结论　K7疫苗病毒在KMB17细胞培养经 35℃和 37℃连续传代 ,无毒力回升和遗传稳定性改变     

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。     

H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCK-G1细胞上的遗传稳定性

目的分析H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCK-G1细胞上的遗传稳定性。方法将H5N1种子毒株在MDCK-G1细胞上传代,收获病毒液作为P2病毒,继续传至P15,每隔5代[即P1(原代)、P5、P10、P15]进行测序。分别以含不同浓度(1、2、4μg/mL)TPCK-trypsin的培养基及不同病毒接种MOI(1、0. 1、0. 01、0. 001、0. 000 1、0. 000 01)在MDCK-G1细胞上培养P1 H5N1病毒,检测血凝滴度,计算CCID50,确定最适MOI及TPCK-trypsin浓度。将P1和P15 H5N1病毒接种鸡胚,收获尿囊液,经Sepharose 4 Fast Flow凝胶柱层析法纯化病毒后,进行电镜观察;采用培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)检测支原体。结果 H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCKG1细胞传代过程中血凝滴度增加,从1∶128升至1∶1 024,P1、P5、P10和P15 H5N1种子病毒8条基因序列(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS)经DNAMAN比对结果一致。H5N1种子病毒株在MDCK-G1细胞传代的最适TPCKtrypsin浓度为4μg/mL,最适MOI为0. 001。两种方法检测P1、P15 H5N1种子病毒株均未被支原体感染。结论H5N1种子病毒株在MDCK细胞中传至P15时,病毒滴度增加但基因序列未发生改变,表明H5N1种子病毒株在MDCK-G1细胞中传代具有一定的遗传稳定性。     

KMB-17细胞株的遗传稳定性

目的研究连续传代的KMB-17细胞株的遗传稳定性。方法将第23代KMB-17细胞连续传代至60代,按常规染色体分析方法,观察不同代次细胞的染色体数目和结构变化。选取核基因组和线粒体基因组中高突变的15个STR位点,经PCR扩增和电泳分析微卫星不稳定性。结果KMB-17细胞株经连续传代培养至56代仍未发生染色体数目和结构改变,微卫星位点也未发生突变。结论KMB-17细胞株连续传代培养后,仍能保持细胞生物学特征及遗传特征的稳定,40代以前的细胞作为疫苗生产基质是安全的。     

轮状病毒P[8]G1株在KMB17细胞上的适应性及其免疫原性

目的研究轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应性及其免疫原性。方法将人轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在KMB17细胞上进行适应培养,连续传代10代,免疫荧光法检测病毒的增殖情况,免疫胶体金法检测病毒的抗原性,微量滴定法检测病毒的感染性滴度,并进行病毒基因组稳定性及免疫原性检测。结果轮状病毒Wa株在KMB17细胞上连续传代后,细胞病变逐渐增快;抗原性逐渐增强;至第10代达增殖高峰,病毒滴度达4.25CCID50/ml;在传代过程中,病毒基因组核酸带型保持一致;经皮下和口服2种途径免疫小鼠,血清抗体效价均达1:8192。结论轮状病毒Wa株可在KMB17细胞上稳定增殖,病毒保持了毒株的基本生物学特性,且具有较好的免疫原性。     

水痘减毒活疫苗Oka株的传代稳定性

目的观察水痘减毒活疫苗Oka株(V-Oka)的传代稳定性。方法将V-Oka病毒在人二倍体细胞MRC-5上连续传代至50代,观察病毒的培养特性。选择32、34、38、42、46、50代病毒进行病毒滴度测定和鉴别试验,提取病毒DNA,对V-Oka的主要基因(ORF31、ORF62、ORF68、R区)进行PCR扩增和测序,并对序列进行分析。结果 V-Oka连续传代至50代,其培养特性、细胞病变一致,病毒滴度为5.0～5.6LgPFU/ml。与GenBank中登录的V-Oka序列比较,32～50代的V-OkaORF31、ORF62、ORF68、R区序列稳定,并趋于减毒型。结论 V-Oka传代至50代,生物学和分子遗传学特性稳定。     

重组口蹄疫鸡痘病毒vUTAL3CP1的构建及其遗传稳定性和免疫原性

目的构建重组口蹄疫鸡痘病毒,并检测其遗传稳定性和免疫原性。方法将口蹄疫病毒(FMDV)的衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL3CP1,并与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU加压筛选获得重组鸡痘病毒vUTAL3CP1。重组病毒在CEF中连续传30代,分别进行毒力和基因检测,并免疫BALB/c小鼠,检测特异性抗体和中和抗体。结果重组鸡痘病毒经RT-PCR可扩增出目的基因;特异性荧光抗体反应呈阳性;在CEF中连续传30代,毒力稳定,基因未发生缺失和变异;免疫小鼠能产生较高水平的FMDV特异性抗体和中和抗体。结论已成功构建重组口蹄疫鸡痘病毒,且具有良好的遗传稳定性和免疫原性。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性

目的探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性。方法用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1MOI接种Vero细胞,进行传代培养,共传13代。采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性。结果Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速。结论用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好。     

以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株,为以Vero细胞为基质生产流感疫苗奠定基础。方法以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)为母本株,与WHO推荐的2007～2008年度北半球流感疫苗生产用毒株A/Caledonia/20/99(H1N1)共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)抗体筛选重配病毒,在Vero细胞连续传12代,采用血凝抑制试验和RT-PCR鉴定病毒型别。将重配病毒经Vero细胞大量培养,重配前的病毒经鸡胚大量培养,分别经甲醛灭活,制备灭活疫苗,免疫ICR小鼠,检测其免疫原性。结果获得了1株Vero细胞适应的高产H1N1流感病毒株,连续传9代后,病毒血凝滴度维持在512,免疫原性与重配前的毒株相比,差异无统计学意义。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H1N1流感病毒Vero细胞适应株。