猪圆环病毒病和繁殖与呼吸综合征二联灭活疫苗的安全性及免疫保护力

目的观察猪圆环病毒病(PCVD)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)二联灭活疫苗的安全性及免疫保护力。方法分别用超剂量疫苗免疫妊娠母猪和3～4周龄断奶仔猪,以观察疫苗的安全性及对妊娠母猪产仔的影响;并用3批疫苗分别免疫3～4周龄断奶仔猪,检测血清中ELISA和中和抗体效价;免疫后28d,分别用PRRSV CC株和PCV2 NM株攻毒,观察临床反应,并进行病理组织学检查,计算疫苗保护率。结果超剂量疫苗免疫对妊娠母猪和断奶仔猪均安全,无任何不良临床反应。免疫断奶仔猪后7d可检测到血清抗体,PCV2及PRRSV攻毒后的保护率均不低于80%。结论 PCVD和PRRS二联灭活疫苗安全、有效,可用于PCVD和PRRS的预防。     

甲型H7N9流感病毒疫苗经不同途径免疫小鼠长期保护效果的比较

目的比较甲型H7N9流感全病毒灭活疫苗和裂解疫苗经3种免疫途径免疫小鼠的长期保护效果。方法采用不同剂量(0. 15和1. 5μg)的甲型H7N9流感全病毒灭活疫苗及裂解疫苗单独免疫或辅以Al(OH)_3佐剂共同免疫,分别经腹腔、肌肉及皮下注射免疫小鼠1次,免疫后不同时间点(3～360 d)收集血清,通过ELISA法检测血清IgG抗体水平。免疫后365 d,用含10×LD_(50)致死量的甲型H7N9流感病毒同源鼠肺适应株A/Shanghai/2/2013(H7N9)经滴鼻攻毒,20μL/只,攻毒3 d,检测小鼠肺洗液的病毒滴度,攻毒21 d,观察小鼠存活和体重丢失情况。结果甲型H7N9流感全病毒灭活疫苗和裂解疫苗接种1次均可诱导小鼠产生较高水平的血清IgG抗体,全病毒灭活疫苗比裂解疫苗IgG抗体滴度峰值高2～8倍,且Al(OH)_3佐剂可有效提高两种疫苗诱导的血清IgG抗体水平。免疫后365 d,全病毒灭活疫苗及含佐剂裂解疫苗免疫均可保护小鼠抵抗同源流感病毒的致死量攻击,且Al(OH)_3佐剂可有效提高H7N9裂解疫苗的保护效果。3种免疫途径中腹腔注射和肌肉注射较皮下注射产生的IgG抗体维持时间更长,免疫剂量相同时,肌肉免疫途径对小鼠的保护效果略优于腹腔和皮下免疫途径。结论 3种途径1次免疫甲型H7N9流感全病毒灭活疫苗或辅以Al(OH)_3佐剂的裂解疫苗,在小鼠模型中可提供至少365 d的保护,腹腔和肌肉免疫途径血清抗体持续时间较皮下途径更长,肌肉免疫途径保护效果略优于另两种途径。     

多克隆抗体对猪繁殖与呼吸综合征的防治效果

目的观察猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)多克隆抗体用于防治PRRS的效果。方法用PRRSV灭活疫苗2次基础免疫,PRRSV(NVDC-JXA1株)强毒C05代加强免疫长白仔猪,制备PRRSV多克隆抗体。以不同剂量的多抗免疫仔猪后,通过仔猪存活率、血清ELISA抗体效价及血清、肺、脑组织PRRSV基因评价多克隆抗体对PRRSV感染的预防和治疗作用。结果仔猪按0.5ml/kg体重接种多抗进行预防,再经PRRSV(NVDC-JXA1)株强毒(3×105.5TCID50)攻击,具有一定的预防作用,存活率为5/7;经NVDC-JXA1株强毒(3×105.5TCID50)感染后,分别按0.8ml/kg和1.0ml/kg剂量,连续注射3次进行治疗,存活率分别为5/7和7/7,但在注射1.0ml/kg的猪中,仍有部分猪血清(4/7)和肺(2/7)PRRSV基因阳性。结论高剂量的多克隆抗体(ELISAS/P>3,0.5ml/kg以上)对仔猪抵抗PRRSV感染具有一定的预防和治疗作用,经多克隆抗体预防或治疗后无临床症状的猪仍可能带毒。     

禽流感病毒抗原-抗体复合物的制备及其免疫原性

目的制备禽流感病毒抗原-抗体复合物,并检测其免疫原性。方法以H5亚型禽流感病毒的HA蛋白为抗原,其病毒的高免卵黄为抗体,将抗原与抗体按不同比例混合,制备禽流感病毒抗原抗体复合物。免疫1日龄SPF仔鸡,进行保护力试验;于免疫后不同时间检测血清HI抗体水平,并与H5亚型油乳剂灭活疫苗进行比较。结果抗原与抗体比例为1∶0.6的抗原-抗体复合物在免疫仔鸡15d后,其诱导的平均抗体水平达6.5log2,与H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗(6.2log2)相比,差异无统计学意义;在等量病毒攻击后,二者对仔鸡的保护率相同(93.3%)。结论制备的禽流感病毒抗原-抗体复合物具有良好的免疫原性,为研制禽流感新型复合物疫苗提供了依据。     

猪瘟病毒生物反应器低血清培养及其免疫效力检测

目的利用生物反应器低血清培养基灌流培养猪瘟病毒,制备猪瘟病毒活疫苗,检测其免疫效价。方法对猪睾丸ST细胞进行低血清培养驯化,待ST细胞适应低血清培养后,接种至生物反应器,当细胞达到接种密度后,感染猪瘟兔化弱毒株(Classical Swine)毒种,培养96 h后,连续收液48 d,收获的病毒液经滤膜过滤后,制备猪瘟病毒活疫苗。将疫苗免疫健康新西兰家兔和28日龄健康仔猪,检测病毒滴度及免疫效价。结果用2%血清培养ST细胞,细胞接毒密度为5×106个/m L,病毒按3%~5%比例接种。利用上述条件培养的猪瘟病毒连续收获20次,病毒滴度均在7 500 RID/m L以上。免疫仔猪后第14天抗体效价达1∶128,未免疫仔猪抗体效价低于1∶16;攻毒后观察16 d,免疫仔猪无任何猪瘟临床表现,保护率100%,而未免疫仔猪在攻毒后第6天开始陆续死亡,死亡率100%。结论用低血清培养ST细胞制备的猪瘟病毒活疫苗具有较高的免疫效价,为猪瘟病毒疫苗生产工艺的改进奠定了基础。     

原型株及变异株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性评价

目的 评价原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性。方法 分别将原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗经大腿肌内免疫5只雌性Wistar大鼠2次,间隔14 d,免疫剂量均为3μg病毒蛋白/（0.5 mL·只）,初次免疫后14、28和42 d,经静脉采集血,分离血清。间接ELISA法检测血清IgG抗体水平;微量中和试验检测血清中和抗体效价;计算血清中和抗体效价的抗原比,以评价2株病毒间的抗原性差异。结果 初次免疫后14 d,全部免疫血清中均可检测到针对4株病毒的IgG抗体,28 d的IgG抗体水平较14 d提高10倍以上,42 d时效价略有下降。首次免疫后14 d,免疫原型株或Delta株疫苗的大鼠血清中,针对4株病毒的中和抗体全部阳转;免疫Beta株和Gamma株疫苗的大鼠血清中,针对Beta株和Gamma株病毒的中和抗体全部阳转,针对原型株或Delta株病毒的中和抗体部分阳转。初次免疫后28 d,4种病毒免疫血清中和抗体均阳转,中和抗体效价较14 d大幅升高;初次免疫42 d时中和抗体效价较28...     

HFRSV在Vero细胞上的传代适应及疫苗的初步研制

作者观察了肾综合症出血热病毒(HFRSV)Z_(10)株、HB_(55)株和L_(99)株在Vero细胞上的传代适应情况,并制备了3批灭活疫苗。试验结果表明,3批疫苗对家兔均有较好的免疫效果,动物经两次免疫后4周,血清中和抗体阳转率为100％。这一结果为应用Vero细胞制备HFRS灭活疫苗提供了有意义的科学数据。     

流行性出血热灭活疫苗对同型和异型病毒的抗体应答

本文对 Z_(10)株出血热活病毒及其灭活疫苗免疫动物或人体后,对同型(野鼠型—血清Ⅰ型)和异型(家鼠型—血清Ⅱ型)病毒的抗体应答进行了试验比较。结果表明,经活毒或疫苗免疫后的家兔,对同型病毒产生的中和及血抑抗体高于对异型病毒的4～8倍。10名自愿者经 Z_(10)株灭活疫苗免疫后,血清的中和及血抑抗体阳转率对同型病毒均为90%,而对异型病毒仅为20～30%。以上结果证实我国野鼠型和家鼠型病毒间的抗原性差异。提示制备二型双价疫苗及筛选对二型均有保护作用的生产用毒株的必要性。     

乙型脑炎减毒活疫苗和灭活疫苗免疫效果评价

目的对目前市场上的乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗和灭活疫苗的免疫效果进行评价。方法将乙脑减毒活疫苗和灭活疫苗以相同剂量免疫小鼠14 d后,采集一部分小鼠血液,分离血清,检测中和抗体水平;另一部分用乙脑病毒强毒P3株进行腹腔攻击,观察小鼠存活情况,计算疫苗的保护率。结果乙脑减毒活疫苗和灭活疫苗原倍免疫小鼠后,抗体阳转率均为100%,乙脑病毒强毒攻击后保护率均为100%;乙脑减毒活疫苗1∶20稀释免疫小鼠后,抗体阳转率为90%,攻击保护率为100%。乙脑灭活疫苗1∶20稀释免疫小鼠后抗体阳转率为80%,乙脑病毒强毒攻击后保护率为70%。结论目前市场上应用的乙脑减毒活疫苗和乙脑灭活疫苗均是有效的,乙脑减毒活疫苗的保护效果更好。但通过接种不同的抗原量和采用不同的免疫程序,均可消除免疫保护效果的差异。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗对大鼠的免疫效果

目的比较不同浓度Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin IPV)3针免疫大鼠的中和抗体效价,为确定Sabin IPV的最佳免疫方案提供参考。方法用不同浓度的Sabin IPV对52只Wistar大鼠进行3针免疫,每针间隔1个月,每次免疫后30d采血并分离血清,采用微量中和试验测定血清中抗脊髓灰质炎病毒3个型的中和抗体效价。结果大鼠经3针Sabin IPV免疫后,其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体的几何平均滴度均显著上升,2针免疫后抗体阳转率已经达到100%,且原倍疫苗与稀释疫苗免疫大鼠后,产生的中和抗体水平差异有显著意义。结论Sabin IPV在大鼠中有良好的免疫效果,经3针免疫可产生高水平的中和抗体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒,并检测其免疫原性。方法用RT-PCR法扩增PRRSV的GP5和M蛋白基因片段,克隆至真核表达载体pIRES-neo中,构建真核表达质粒pIRES-G和pIRES-M,制备核酸疫苗,以其单独或联合免疫小鼠,检测其免疫原性。结果真核表达质粒pIRES-G和pIRES-M经酶切鉴定证明构建正确。第1次免疫后4周,各重组质粒免疫组小鼠血清ELISA抗体水平均显著升高,其中pIRES-G + pIRES-M组抗体水平最高;第1次免疫后9周,pIRES-G + pIRES-M组小鼠血清中和抗体效价(1∶16)高于pIRES-G组(1∶8)和pIRES-M组(1∶4),但均低于灭活疫苗组(1∶64);第1次免疫后9周,与pIRES-neo组相比,各组免疫小鼠脾细胞经特异性(PRRSV)和非特异性(ConA)抗原刺激后,均有明显的增殖,对非特异性刺激反应比特异性刺激反应略强。结论已成功构建PRRSV GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒,二者联合免疫效果更好。     

白油佐剂粒径均一性与炎症和免疫学效应的相关性

采用高速搅拌和快速膜乳化法制备鸡新流二联白油佐剂疫苗,考察了疫苗粒径均一性与疫苗引起的炎症反应和免疫学效应的关系. 结果表明,2种疫苗粒径约为1.0 mm,快速膜乳化疫苗(ME vaccine)的多分散系数(PDI)为0.036,高速搅拌疫苗(HS vaccine)的PDI值为0.279,前者粒径分布更均一. 两种疫苗的HI抗体和IgG抗体水平无显著差异. HS vaccine注射部位炎症因子IL-1b, IL-6, IL-17, TNF-a表达量最高分别为45, 7, 25和80 pg/mL,显著高于ME vaccine(均低于5 pg/mL). 均一白油佐剂疫苗在诱导有效免疫应答的同时,引起的炎症反应更轻.     

Al-Pickering乳液提高口蹄疫疫苗热稳定性的应用

口蹄疫疫苗是一种重要的兽用疫苗,对畜牧业的发展具有重要作用。但其存在抗原热稳定性差、易失活等问题。目前,有研究者对口蹄疫病毒五聚体交界处的氨基酸改造,作为提高口蹄疫疫苗热稳定性的策略之一。然而这种方法操作复杂,要针对不同血清型病毒衣壳进行分别设计。为解决这一问题,本工作提出将抗原稳定与佐剂设计相结合的策略,构建Pickering乳液,以期提高口蹄疫疫苗的热稳定性。采用水热法制备得到了球状、棒状、片状氢氧化铝颗粒,在此基础上以角鲨烯为油相制备粒径均一的Al-Pickering乳液。随后采用差示扫描荧光法评价了灭活口蹄疫病毒(iFMDV)与Al-Pickering乳液结合后的热稳定性,结果表明各组Al-Pickering乳液对iFMDV热稳定性均有提高,其中棒状-Pickering乳液提升效果最佳,将iFMDV裂解温度提高了1.7℃。同时,动物实验结果表明Al-Pickering乳液能够增强iFMDV特异性抗体IgG分泌水平。综上,制备的Al-Pickering乳液能够稳定抗原结构并增强体液免疫水平,且制备工艺简单。该研究为提高疫苗热稳定性的佐剂研究提供了新的选择。     

Production and Evaluation of Virus-Like Particles Displaying Immunogenic Epitopes of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV)

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is the most significant infectious disease currently affecting the swine industry worldwide. Several inactivated and modified live vaccines (MLV) have been developed to curb PRRSV infections. However, the efficacy and safety of these vaccines are unsatisfactory, and hence, there is a strong demand for the development of new PRRS universal vaccines. Virus-like particle (VLP)-based vaccines are gaining increasing acceptance compared to subunit vaccines, as they present the antigens in a more veritable conformation and are readily recognized by the immune system. Hepatitis B virus core antigen (HBcAg) has been successfully used as a carrier for more than 100 viral sequences. In this study, hybrid HBcAg VLPs were generated by fusion of the conserved protective epitopes of PRRSV and expressed in E. coli. An optimized purification protocol was developed to obtain hybrid HBcAg VLP protein from the inclusion bodies. This hybrid HBcAg VLP protein self-assembled to 23-nm VLPs that were shown to block virus infection of susceptible cells when tested on MARC 145 cells. Together with the safety of non-infectious and non-replicable VLPs and the low cost of production through E. coli fermentation, this hybrid VLP could be a promising vaccine candidate for PRRS.     

表达PRRSV GP5、GP3和猪IL-18的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的研制安全有效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法将PRRSV长春株的GP5和GP3基因插入到含有猪IL-18基因的鸡痘病毒转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL-IL-18-GP5-GP3。将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过3次BrdU加压筛选,经PCR、RT-PCR和IFA方法鉴定重组病毒。结果从重组鸡痘病毒基因组和总RNA中扩增出340bp的目的基因片段,感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建1株重组鸡痘病毒,并可正确表达PRRSVORF5/ORF3基因。     

铝佐剂颗粒化乳液制备及其免疫效果研究

铝佐剂是我国唯一临床批准使用的疫苗佐剂，但其自身难以引发有效的细胞免疫应答，无法对机体产生综合性的保护，难以满足日益增长的疫苗佐剂需求。因此，如何合理化改造铝佐剂，保证疫苗佐剂的安全及高效诱导免疫反应是亟待解决的问题。本工作通过对商品化铝佐剂制备乳液超声条件的优化，最终研究表明当颗粒浓度为2.0 mg/mL，水相缓冲液选择蒸馏水且pH为7.0时能制备得到稳定的颗粒化乳液(Alum Particulate Emulsion, APE)，制备得到的乳液平均粒径为2723.7±435.3 nm，Zeta电位为+40.5±1.5 mV。离心发现此时体系中没有游离的铝佐剂，表明2.0 mg/mL是能稳定乳液的最小颗粒浓度。将乳液与抗原共混，测量抗原的吸附率，结果显示，抗原的吸附率接近100%，共聚焦的结果也验证了乳液对抗原的高吸附特性。当乳液与DC (Dendritic Cells)细胞共孵育，可以观察到乳液的内吞及溶酶体逃逸，而传统的铝佐剂无法实现。ELISpot结果显示，APE组脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量比铝佐剂组增加300%左右。将铝佐剂通过颗粒化的策略制备得到APE以后，改变了佐剂增强抗原的免疫效果，显著提升了传统铝佐剂的细胞免疫效果。     

甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)和灭活疫苗(L8株)诱导小鼠体液及细胞免疫应答

目的评估甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗的免疫学效果。方法用甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)和灭活疫苗(L8株)分别经腹腔免疫BALBc小鼠后,用ELISA法检测血清中抗HAVIgG、TNFα、IFNγ和IL2;用流式细胞仪对全血中T细胞亚群分类;3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖。结果减毒活疫苗组在初免后诱导的体液和细胞免疫水平均低于灭活疫苗组,加强免疫后,与灭活疫苗相当。灭活疫苗组IFNγ的峰值出现时间较减毒活疫苗组晚,但水平较高。结论两种疫苗均可诱导体液和细胞免疫应答,减毒活疫苗进行加强免疫后可诱导更好的系统免疫应答。     

硅油微胶囊及其水性防覆冰涂料的制备与性能

采用细乳液技术制备了一种以二氧化硅为壳层的硅油微胶囊乳液.考察了乳液pH、表面活性剂组成和核壳比例等因素对微胶囊制备的影响,获得了稳定性好、固含量高达17.6%、以二氧化硅为壳层的硅油微胶囊乳液.将此硅油微胶囊乳液与丙烯酸乳液和颜填料混合配制成水性抗覆冰涂料,考察了硅油微胶囊含量和颜基比对涂层老化前后的水接触角和覆冰附...