抗ICAM-1单克隆抗体的制备及其活性

目的制备具有生物活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体。方法以人ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术并经HAT选择培养和克隆化,筛选出稳定分泌抗人ICAM-1 McAb的杂交瘤细胞株,并对McAb进行纯化。用ELISA间接法测定效价并鉴定其亚类,Western blot鉴定其抗原特异性,细胞黏附试验检测其中和活性。结果筛选出1株可稳定分泌抗人ICAM-1抗体的杂交瘤细胞株3F2,杂交瘤染色体众数为98~104。纯化后的单抗蛋白浓度为1.253 mg/ml,纯度达83.6%,效价可达2.56×105。其分泌的抗体亚型为IgG1,腹水效价达5.12×105,可与ICAM-1特异性结合,可抑制ICAM-1与淋巴瘤细胞间的黏附,具有明显的中和ICAM-1的活性。结论已成功制备出抗ICAM-1的McAb,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备单纯疱疹病毒的单克隆抗体。方法 用纯化的单纯疱疹病毒（HSV）抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得两株分泌抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗,检测该单抗的特异性。结果 这两种单抗与其他相关的病毒抗原无交叉反应,Western blot表明单抗均识别单纯疱疹病毒中相对分子质量50000的蛋白。结论 该单抗为单纯疱疹病毒的单克隆抗体。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

分泌抗HBsAg-抗HRP双特异单克隆抗体杂交-杂交瘤的建株

用分泌抗-HBs Ag单克隆抗体的杂交瘤细胞的8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)耐受株作为亲本细胞,与辣根过氧化物酶(HRP)免疫的BALB/c小鼠脾细胞进行第2次融合,从382个克隆上清中筛选出一株分泌抗-HBs Ag-抗-HRP双特异抗体的阳性孔。经多次克隆纯化建立3株杂交-杂交瘤,命名为Bs33、Bs38和Bs39,其抗体均属Ig G_1型。细胞染色体平均为113条。细胞反复冻存、复苏、传代仍稳定分泌双特异抗体。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

幽门螺杆菌HpaA蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备幽门螺杆菌(H.pylori)HpaA蛋白单克隆抗体,并检测其对H.pylori黏附胃腺癌细胞AGS的抑制作用。方法应用PCR法扩增HpaA基因,构建重组表达质粒pQE30-HpaA,表达并纯化重组HpaA蛋白;以其为抗原免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,采用间接ELISA和Western blot法检测单抗的特异性,间接ELISA检测细胞株培养上清和腹水抗体效价,并对其进行亚型鉴定和杂交瘤细胞株稳定性分析;扫描电镜观察重组HpaA蛋白单抗对H.pylori黏附AGS细胞的抑制作用。结果重组表达质粒pQE30-HpaA经双酶切、PCR及测序证明构建正确;表达的重组HpaA蛋白相对分子质量约为30 000,可溶性蛋白含量约占65%,纯化后纯度达85%以上;经细胞融合及筛选克隆获得了2株能稳定分泌抗HpaA单抗的杂交瘤细胞株,2株单抗与其他肠道细菌均无交叉反应,能与H.pylori全菌体发生特异性反应;乳胶凝集试验证明,该单抗属IgG3、κ型;2株单抗细胞培养液的抗体效价分别为1∶128～1∶256和1∶64～1∶128,腹水抗体效价分别可达1∶6 400～1∶12 800和1∶1 600～1∶3 200;杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体;单抗可抑制H.pylori对AGS细胞的黏附作用。结论已成功制备了H.pylori HpaA蛋白单克隆抗体,为建立新的H.pylori现症感染诊疗方法奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法采用超速离心纯化的IBRV全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞,通过融合剂PEG与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接免疫荧光法(IFA)筛选杂交瘤细胞,并制备腹水,分析单抗的生物学特性。结果筛选出1株稳定分泌抗IBRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为3C1。单抗的重链为IgG1亚类,轻链为kappa链;上清和腹水效价分别为1∶40和1∶12 800;单抗可与IBRV及gD重组蛋白分别在相对分子质量71 000和96 000处发生特异性反应,可与感染IBRV的MDBK细胞发生特异性结合,产生荧光。结论成功制备了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体,为深入研究gD蛋白功能及IBR的临床诊断方法筛选等提供了数据材料。     

抗人红细胞表面抗原glycophorin A杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术,用纯化人红细胞表面抗原glycophorin A“N”型免疫纯系BALB/c小鼠,用glycophorin A“M”型作为固相抗原,用EIA间接筛选出识别“M”、“N”血凝抗原以外的抗glycophorin A的抗体,进而利用Coombs原理,加入抗免疫球蛋白,筛选出非凝集型抗glycophorin A抗体,得到61株非凝集型抗glycophorin A杂交瘤,其中12株有限稀释法克隆4次后得到5株稳定分泌非凝集型抗体的杂交瘤并进行初步鉴定。单抗上清血凝效价可达1:20～50,腹水血凝效价为1:800～1:1 600。     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)单克隆抗体,并进行鉴定。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心法对猪HEV进行纯化,免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选能稳定分泌抗HEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗进行生物学鉴定。结果筛选出4株能稳定分泌抗HEV单抗的杂交瘤细胞株2H2、2A1、1E2、4D4。经鉴定,4株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水抗HEV的ELISA效价可达1∶12800～1∶51200,其中3株HI效价可达1∶24～1∶28,另1株为0。4株杂交瘤细胞分泌的单抗与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;杂交瘤细胞染色体数为83～103;除2A1单抗为IgG2b外,其他3株均为IgG1;Westernblot分析表明,2H2、2A1和4D4能识别HEV的血凝素-酯酶蛋白(HE),1E2可识别纤突蛋白(S)。结论已成功制备出抗HEV的单克隆抗体,为HEV快速检测试剂的研制奠定了基础。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

牛心肌肌钙蛋白T的提取、纯化及其单克隆抗体的制备

目的提取、纯化牛心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT),并制备其单克隆抗体。方法采用组织匀浆、蛋白层析技术提取、纯化牛cTnT,紫外分光光度法检测其浓度;SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA法检测其反应特性。将纯化的牛cTnT免疫小鼠,进行细胞融合,间接ELSIA法筛选阳性杂交瘤细胞株,采用小鼠体内法制备腹水。结果纯化的两批牛cTnT浓度分别为0.246和0.336 mg/ml;相对分子质量约为37 000,纯度分别为86.02%和93.77%;纯化的cTnT蛋白可与鼠抗牛cT-nT单克隆抗体结合。共获得5株分泌抗牛cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,阳性杂交瘤细胞株3B10腹水抗体效价达1∶10 240。结论已成功提取、纯化了牛cTnT,并建立了稳定分泌抗牛cTnT单抗的杂交瘤细胞株,为cTnT检测试剂盒的国产化奠定了基础。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。     

抗旋毛虫硒蛋白T单克隆抗体的制备及其对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果

目的制备抗旋毛虫与肝癌H7402细胞相关抗原硒蛋白T单克隆抗体,并观察其对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果。方法用纯化的旋毛虫硒蛋白T重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体;将肝癌H7402细胞经大腿内侧皮下接种BALB/c裸鼠,1×10^7个细胞/只,采用制备的高效价单抗,按20、50及100μg/只剂量接种裸鼠,隔日1次,共5次,评价单抗对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果。结果成功获得了3株稳定分泌抗旋毛虫硒蛋白T的单抗的细胞株:4D4、4H2及4F1,效价均达1∶204800以上,其中4H2抗体效价最高;20、50及100μg/只剂量组的抑瘤率分别为51.6%、56.2%和80.3%。结论制备的抗旋毛虫与肝癌H7402细胞相关抗原硒蛋白T单克隆抗体对裸鼠体内肝癌H7402细胞具有明显的抑制效果。