脊髓灰质炎病毒颗粒分离纯化方法学评价

目的比较3种不同密度梯度离心方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。方法选择蔗糖密度梯度离心、氯化铯密度梯度离心、Optiprep(碘克沙醇溶液)密度梯度离心方法,对脊髓灰质炎病毒进行纯化,抽取离心之后的蛋白条带,通过计算蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒颗粒透射电镜观察,评价其对病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。结果病毒液经蔗糖、氯化铯和Optiprep 3种介质超速离心,均能分离空心颗粒和实心颗粒。氯化铯密度梯度离心法蛋白回收率优于Optiprep及蔗糖密度梯度离心法;Optiprep密度梯度离心法蛋白纯度优于氯化铯及蔗糖密度梯度离心法。结论通过蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒颗粒透射电镜观察初步评价了3种方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒和实心颗粒的分离效果,为脊髓灰质炎病毒分离纯化提供了参考。     

蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量(600、700和800 ml)时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间(2、3和4 h)条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。     

大规模纯化脊髓灰质炎病毒的蔗糖垫层离心法的建立

目的建立可大规模纯化脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)的蔗糖垫层离心法。方法病毒大量增殖后,收集病毒液,经PEG浓缩、三氟三氯乙烷抽提后,采用蔗糖垫层或Cs Cl密度梯度离心法纯化PV(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),电镜下观察病毒形态,进行核酸及感染性滴度的检测。将纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV免疫豚鼠,心脏采血,分离血清,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果蔗糖垫层离心法纯化的各型PV,病毒颗粒形态典型,背景清晰,除完整的光滑型病毒颗粒外,还可见大量空心病毒颗粒样品,纯化效果较好;Cs Cl密度梯度离心法纯化的PV样品,病毒形态也较典型,但完整的病毒颗粒较多。两种纯化方法获得的病毒基因组核酸特征显著,背景清晰,无明显差异。蔗糖垫层离心法纯化的各型PV的感染性滴度及免疫后豚鼠血清中和抗体滴度均高于Cs Cl密度梯度离心法。结论蔗糖垫层离心法纯化的PV纯度高,免疫原性好,可用于大规模纯化PV或其他病毒。     

流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化

目的优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速离心的纯化效果,以及TritonX-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果层析法纯度稍高于蔗糖密度梯度超速离心法,而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。TritonX-100的裂解效果优于去氧胆酸钠,裂解剂浓度为0.5%或0.8%,裂解3或4h,裂解率达90%以上。疫苗在4℃保存1年后,所有检测项目均合格,4℃保存18个月和37℃保存28d后,HA含量仍保持在30μg/ml以上。结论已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。     

B型流感病毒血凝素的纯化

目的纯化B型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)。方法使用不同浓度的菠萝蛋白酶酶切B型流感病毒HA,超速离心获得含HA的上清后,经蔗糖密度梯度离心进行纯化,HPLC分子筛分析纯化效果。纯化后的蛋白经糖苷酶PNGaseF处理后,切取丰度较高的蛋白条带,进行质谱鉴定。结果病毒蛋白与菠萝蛋白酶蛋白含量的最佳比例为40∶1;5%~30%梯度浓度的蔗糖能很好地去除低相对分子质量的蛋白,流感病毒内丰度较高的NP及M蛋白得到很好的去除;纯化的HA蛋白的纯度大于90%,且HPLC分析显示仅有1个主峰,均一性良好。结论优化了B型流感病毒HA蔗糖密度梯度离心纯化方法,获得了高纯度的HA蛋白,为制备HA标准抗血清奠定了基础。     

不同方法制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的质量比较

目的比较不同纯化方法制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的质量。方法用柱层析一步法、两步法、区带离心法纯化工艺制备Vero细胞乙脑纯化疫苗各3批,比较杂蛋白去除率、抗原比活性、纯度、HCP残留。结果3组杂蛋白去除率分别为97.0%、99.1%和99.6;抗原比活性分别为0.35、0.59和0.68EU/μg;抗原回收率分别为82.3%、49.6%和30.3%;HCP残留量分别为10.40、0.70和0.13μg/ml,纯化液中每微克蛋白中残余HCP(ng)的含量平均为139.3、32.9和9.3ng。结论蔗糖梯度离心法制备的Vero细胞乙型脑炎疫苗抗原活性、纯度、杂蛋白去除效果、HCP残余量均优于两种柱层析法。两步柱层析法优于一步法。     

正交试验设计优化流感病毒纯化工艺

目的通过正交试验优化流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化工艺条件。方法以影响流感病毒纯化效果的蔗糖溶液用量、上样量、超速离心时间及上样速度为试验因素,每因素设3个水平,通过正交试验设计9组试验。每组试验流感病毒浓缩液纯化后获得的样品进行血凝滴度及蛋白含量检测,计算血凝滴度收率和蛋白去除率;根据正交试验血凝滴度收率、R值及K值结果,确定最适纯化工艺参数。采用最适纯化工艺对中试3批流感病毒浓缩液进行纯化。结果正交试验结果表明,影响流感病毒纯化效果因素的重要性依次为超速离心时间、蔗糖溶液用量、上样量、上样速度,最适纯化工艺参数为超速离心时间3 h,30%蔗糖溶液用量500 mL/台,上样量为700 mL/台,上样速度为60 m L/min。3批中试病毒浓缩液纯化后的血凝滴度收率均 90%,满足工艺需求。结论采用正交试验获得的流感病毒纯化工艺适合于规模化生产。     

纯化病毒疫苗的通用方法

各地药审部门近年要求提高疫苗的安全性，以降低副作用，纷纷强制改进病毒疫苗的生产和纯化方法。例如，流感病毒疫苗的生产正开始用VERO细胞取代鸡胚培养。纯化方法已放弃蔗糖密度梯度离心这类传统方法，而走向自动化程度更高、更易于在位清洗的超滤和液相层析技术。以下的人流感病毒疫苗纯化，是一种通用的病毒疫苗纯化策略。     

Benzonase酶去除流感疫苗中Vero细胞DNA条件的优化

目的优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求。方法向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于37℃酶解不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h),经100 k D超滤离心管,用不同p H(7.10、7.30、7.50、7.70、7.90)的PBS进行洗滤浓缩。将Benzonase酶处理的病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化,去除部分杂蛋白,电镜下观察病毒的形态。结合两步柱层析法进一步去除Vero细胞DNA。结果 H5N1流感病毒液经终浓度为10 U/ml的Benzonase酶,37℃处理2.5 h后,用p H为7.50的PBS溶液进行洗滤,其DNA去除率可达99%以上。Benzonase酶处理前后病毒形态一致,结构完整,轮廓清晰。在用酶处理去除原液中大部分Vero细胞残余DNA的基础上,结合两步柱层析法基本可使疫苗残余外源DNA达到100 pg/剂的限定标准。结论非限制性核酸内切酶Benzonase可高效降解H5N1流感病毒液中的DNA,此方法降低流感疫苗中Vero细胞DNA简单可行,大大降低了后续工艺去除DNA的压力,同时结合两步柱层析法可使疫苗中DNA残余达到限定标准,为以Vero细胞为基质大流行流感疫苗的研发奠定了基础。     

重组人IL-31蛋白纯化方法的比较研究

目的比较两种方法纯化rhIL-31的效果。方法将含pET32a/rhIL-31的重组菌E.coli.BL21(DE3)经IPTG诱导表达,通过超声波破碎,包涵体的提取溶解,分别经G75凝胶层析和镍琼脂糖凝胶FF层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分析。结果镍琼脂糖凝胶FF层析法的杂蛋白去除率高于凝胶层析法,所得蛋白纯度略高。结论比较重组人IL-31蛋白的纯化效果,镍琼脂糖凝胶FF层析的效果比G75凝胶层析的效果好。     

肾综合征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗纯化方法的研究

目的 建立简便、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。方法 采用超滤浓缩、醋酸锌沉淀和柱层析（亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析）等方法，对出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗进行提纯对比试验。结果 用超滤浓缩和Sepharose 4FF凝胶柱层析或用醋酸锌沉淀和凝胶柱层析，纯化的疫苗均可达到质量标准，而用 cellufine sulfate gel亲和层析和离子交换层析均不理想。结论 建立了经济、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。     

柱层析法纯化基因工程HBsAg中试工艺的研究

由乙肝病毒S基因转化的哺乳动物细胞培养收液，经过Butyl-S-SepharoseFF层析，DEAESepharoseFF层析和Sepharose4FF层析，可获HBsAg纯品。产品检定结果表明，PAGE和SDS-PAGE电泳纯度均合格，小牛血清残余量、细胞DNA残余量和动物免疫效力也均符合规定标准．HBsAg终收率达40％左右．在此工艺中，疏水作用柱层析的纯化效率比较高，可去除绝大部分杂蛋白和细胞DNA。     

重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌发酵及表达产物的纯化

目的建立稳定、高效表达重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)的工程菌发酵及表达产物纯化工艺。方法规模化发酵表达rEPA的重组大肠杆菌rPE553D,离心收集菌体,渗透压调解使菌体周质间隙蛋白释放后,高速离心收集蛋白溶液。经DEAESepharoseFF、PhenylSepharose6FF疏水层析和SOURCE30Q强离子交换层析,超滤浓缩纯化rEPA。用HPLC、SDS-PAGE和Westernblot等方法检定生化和免疫学特性,并用小鼠和Vero细胞检定毒性。结果每55L培养基中rEPA产量超过4g,纯度在95%以上,细胞毒性降低了至少32000倍。其余各项指标均符合《中国生物制品规程》要求。结论已建立了收率高、纯度好、稳定、适合规模化生产rEPA的工艺。     

肾综合征出血热灭活疫苗的纯化

目的为提高肾综合征出血热（ＨＦＰＳ）疫苗的免疫效果和减少副反应。方法用ＥＬＩＳＡ检测ＨＦＲＳ 病毒抗原的方法,比较疫苗原液通过不同孔径滤膜的浓缩效果;比较离子交换和凝胶过滤的纯化效果。结果用 孔径３０万相对分子质量滤膜浓缩时,过滤液中仍有部分病毒抗原检出,经１０万相对分子质量滤膜过滤后,过滤液 中检测不到病毒抗原;用 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ凝胶柱层析浓缩时,经波长 ２８０ ｎｍ检测到 ３个吸收峰,其中仅在第 １峰中检 测到病毒抗原,收集第１峰,几乎回收全部病毒抗原,去除杂蛋白约９０％左右。结论本纯化方法适合于ＨＦＲＳ疫 苗的规模化生产。     

不同色谱介质用于鼠腹水中低等电点单克隆抗体的纯化

从一低等电点单克隆抗体（C50,CEA单抗）鼠腹水中纯化单抗,对10种色谱介质在其离子强度、pH、流速等最佳的条件下的纯化效果进行了对比,结果表明腹水先用40％饱和硫酸铵处理后,经一次色谱柱纯化,纯度可达83．6％～96％,回收率为50％～94％。在各种阴离子交换介质中,QSepharoseFF的效果最好,弱阴离子交换介质WhatmanDE52的效果较差。尽管两种强阳离子交换介质的效果较好,但劣于QSepharoseFF及亲会色谱介质HiTrapProteinG。Poros50A纯化IgG1类单抗时需要较高的盐浓度,不能作为最佳候选介质。SephacrylS-200HR及PhenylSepharose6FF纯化产物回收率及纯度均较低,不适于该单抗的纯化。     

流感病毒的裂解、纯化及抗原性研究

［摘 要］目的 研究适于大规模生产的流感病毒裂解剂、裂解和纯化方法。方法 使用不同表面活性剂（Triton X100和去氧胆酸钠）、不同浓度和时间进行裂解，通过电镜进行裂解效果观察。裂解后经密度梯度离心纯化，并进行抗原性试验。结果 Triton X100的裂解效果优于去氧胆酸钠，应用 1．0％ Triton X100裂解 90min效果较好。裂解率达90％以上。裂解后纯化的样品抗原性与进口疫苗类似。结论 该工艺适于流感裂解疫苗大规模生产。     

流行性感冒纯化疫苗的研究

［摘 要］目的 研制安全有效的流感疫苗。方法 将A1、A3和B三株流感病毒分别接种鸡胚，取尿囊液，灭活后，经超滤浓缩再经Sepharose-4FF层析纯化，除菌过滤后制成疫苗。结果 该疫苗的主要技术指标：血凝素含量、卵清蛋白含量、总蛋白含量及细菌内毒素均符合 WHO规程要求标准［1］，人体接种后无副作用，抗体阳转率三株均达99％以上。结论 以该纯化工艺制备的流感疫苗安全有效。     

改良维持液培养aG株狂犬病病毒制备病毒原液

目的通过改良维持液的缓冲体系,改进aG株狂犬病病毒的培养条件,制备高滴度的病毒原液。方法在传统病毒维持液的基础上,补加缓冲盐和碳酸氢钠,在相同的条件下,分别用传统维持液和改良维持液培养病毒,收获2次病毒液,混合,经300 KD膜包超滤、Sepharose 4FF纯化后,制成病毒原液,采用ELISA法检测抗原含量,按《中国药典》三部(2010版)方法检测病毒滴度、效力、宿主DNA和宿主细胞蛋白残留量,用便携式pH计检测pH值。结果改良维持液制备的病毒原液的抗原含量、病毒滴度及效力均高于对照维持液;两种维持液制备的病毒原液的宿主蛋白和宿主细胞DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)要求;改良维持液的缓冲能力明显增强,对病毒培养过程中pH值的控制明显优于对照维持液。结论改良维持液培养狂犬病病毒制备的病毒原液滴度较高,可改进传统aG株狂犬病病毒生产的病毒原液滴度较低的现状。