实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为：上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0～8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。     

巢湖蓝藻藻蓝蛋白纯化工艺的优化

目的优化巢湖蓝藻藻蓝蛋白的纯化工艺。方法将新鲜蓝藻藻泥经冻融破壁处理,获得藻蓝蛋白粗提液。采取两步盐析及Cellfine A-500阴离子交换层析结合法进行纯化,并以纯度和回收率为检测指标,对一步盐析摩尔浓度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mol/L)及二步盐析摩尔浓度(1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mol/L)、阴离子交换层析缓冲液pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、进样浓度(0.418、0.726、1.044、1.288、2.090 mg/L)、洗脱速度(0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 cm/min)及洗脱液盐梯度浓度[(0.08、0.10、1.0)、(0.08、0.15、1.0)、(0.08、0.20、1.0)、(0.08、0.25、1.0)、(0.08、0.30、1.0)mol/L]进行优化。同时采用最适条件纯化3批藻蓝蛋白。结果两步盐析的最适摩尔浓度分别为1.0和1.8 mol/L,阴离子交换层析最适条件为缓冲液p H 7.0,进样浓度为1.0～2.0 mol/L,洗脱流速为2 cm/min,洗脱液盐梯度浓度为0.08、0.20、1.0 mol/L。最适条件纯化的3批藻蓝蛋白纯度可达4.0以上,回收率达11%以上。结论成功优化了巢湖蓝藻藻蓝蛋白的纯化工艺,纯化出了试剂级(纯度4.0以上)的藻蓝蛋白。     

链球菌溶血素与真菌果胶酶融合表达及纯化条件的优化

目的优化链球菌溶血素(streptolysin O,SLO)与真菌果胶酶(pectin lyase,PL)的融合表达及纯化条件。方法将活化培养的工程菌以2%接种量接种于发酵液体培养基中,于37℃,200 r/min培养至不同生长期(A_(600)值分别为0.6、0.8和1.0),分别于不同温度(10、15、20、25、30、35和37℃)及加入不同终浓度IPTG(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 mmol/L)条件下诱导表达不同时间(6、12、20、24、36、48和60 h)。将诱导表达的融合蛋白进行Ni离子亲和层析纯化,对纯化中的上样缓冲液(binding buffer,分别含0、5、10、15、20、25、30 mmol/L咪唑)、清洗缓冲液(washing buffer,分别含0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L咪唑)及洗脱缓冲液(elution buffer,分别含100、200、500、1 000 mmol/L咪唑)的咪唑浓度进行优化。结果最佳诱导表达条件为:工程菌培养至A_(600)为0.8时,加入0.4 mmol/L IPTG,于20℃诱导24 h,目的蛋白的相对分子质量约91 500,占全菌总蛋白的38.6%,溶血活性可达4.0×10~7U/ml。最佳纯化条件为:binding buffer和washing buffer最佳咪唑浓度为5和60 mmol/L,elution buffer分别使用200和500 mmol/L咪唑进行阶段性梯度洗脱,纯化产物纯度可达95%。结论成功优化了SLO与PL融合蛋白的表达及纯化条件,纯化后获得了纯度较高的融合蛋白,为进一步研究SLO蛋白的性质及应用奠定了基础。     

减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体方法的建立

目的建立减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体的方法。方法通过在Protein L层析纯化重组蛋白TP25使用的洗脱缓冲液中添加半胱氨酸(L-cysteine,Cys)等保护剂,并采用碱性溶液中和洗脱液的方法优化多聚体去除条件,经非还原SDS-PAGE检测纯化过程中目的蛋白多聚体的变化情况,葡聚糖凝胶Sephadex G25层析去除洗脱液中Cys。结果去除Protein L层析形成多聚体的最适条件为:用含Cys终浓度为100 mmol/L的20 mmol/L柠檬酸溶液进行直接洗脱,并经0. 5 mmol/L的NaOH溶液中和。该条件下纯化的目的蛋白纯度可达95%以上,且多聚体含量大幅减少。葡聚糖凝胶Sephadex G25可有效去除半胱氨酸。结论在洗脱液中添加Cys可有效减少重组蛋白TP25在Protein L层析纯化过程中多聚体的形成。     

离子交换树脂法提纯维生素C磷酰化反应液

采用D301大孔弱碱阴离子交换树脂分离提纯维生素C磷酰化反应液.测定了室温下D301树脂吸附维生素C磷酸酯钠的动力学曲线和吸附等温线,考察了溶液pH值、温度、盐酸洗脱液浓度等因素对吸附的影响.最后用D301树脂对磷酰化反应液进行梯度洗脱,并用HPLC进行分析.结果表明D301树脂吸附维生素C磷酸酯钠约60 min达到平衡,Freundlich方程可以较好地描述树脂对维生素C磷酸酯钠的吸附.在室温下将磷酰化反应液调节pH至1～2后上柱吸附,依次用0.05 mol/L、0.2 mol/L、2.0 mol/L的盐酸溶液洗脱,收集0.2 mol/L盐酸洗脱液,用HPLC分析,结果其维生素C磷酸酯含量大于97%.     

离子交换树脂吸附分离人凝血酶原复合物研究

用静态方法研究了扩张床用离子交换树脂Streamline DEAE对人凝血酶原复合物（以下简称PCC）的吸附性能，在此基础上初步考察了扩张床条件下的穿透吸附效果。结果表明：在静态条件下，离子强度和缓冲液浓度对平衡吸附量有着较大的影响；Streamline DEAE对PCC的吸附符合Langmuir模型，在15℃和25℃条件下其饱和吸附量分别为66．67mg／g和80．00mg／g。在扩张床条件下，Streamline DEAE对PCC的动态吸附量达36．36mg／mL；用2．0mol／L NaCl、0．01mol／L磷酸缓冲液浓度、pH=7．0的洗脱液对吸附了PCC的凝胶树脂进行洗脱，静态洗脱率达80％以上，动态洗脱曲线表明有较好的洗脱效果。Streamline DEAE对PCC的吸附洗脱性能表明，该树脂可用于扩张床吸附分离PCC的工艺。     

锌离子螯合亲和层析分离纯化谷胱甘肽的研究

以谷胱甘肽的酵母抽提液为原料,用自制的以壳聚糖小球为载体、Zn2 为配基的金属螯合亲和层析柱分离纯化谷胱甘肽(GSH).用含0.5 mol·L-1NH4Cl的pH值4.2、0.02 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液洗脱,然后经浓缩、冷冻干燥处理,即得到分离纯化的GSH.结果表明,上柱谷胱甘肽抽提液浓度为 132.30 mg·(100 mL)-1、上柱pH值为7.0时,谷胱甘肽回收率为68.61%;洗脱液中氯化铵浓度为0.5 mol·L-1、洗脱pH值为6.0时,谷胱甘肽洗脱回收率达到44.47%.     

表面活性剂复配体系修复芘污染土壤实验

以芘污染土壤为对象,利用阴离子表面活性剂鼠李糖脂和非离子表面活性剂皂素进行复配实验,得出最佳复配比并对污染土壤进行修复处理;其次,研究表面活性剂浓度、pH及CaCl₂、MgCl₂、KCl三种离子浓度、洗脱液的回收次数等单因素对洗脱效果的影响;然后利用响应曲面分析,确定影响洗脱效果的主效应因素及其交互作用强度;最后用Box-Behnken模型优化复配体系处理芘污染土壤的实验条件。结果表明：①当复配比为0.2时,鼠李糖脂-皂素混合溶液的表面张力最低,对芘的协同增溶效果最好;②复配体系处理芘污染土壤的单因素实验中,复配药剂浓度、pH、Mg²⁺浓度分别达到1800mg/L、8、0.1mmol/L时,洗脱效率最高;③环境因素对芘去除效果的影响从大到小依次为pH>表面活性剂浓度>Mg²⁺浓度,表面活性剂浓度与pH对芘的洗脱产生较大的交互影响作用,而pH与盐浓度的交互作用最微弱;④Box-Behnken模型优化后得出最佳组合是混合表面活性剂浓度为1900mg/L、pH为5、Mg²⁺浓度为0.2mmol/L,得到的洗脱效率为89.25%。     

重组人生长激素-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱检测方法的优化及验证

目的 优化重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法 ,并对优化的方法 进行验证。方法 利用SEC-HPLC法对rhGH-Fc免疫融合蛋白中多聚体含量进行检测,优化检测条件(盐浓度、流动相pH、流速、柱温及色谱柱型号),观察目的 蛋白与聚合体分离的效果。对方法 的系统适应性、专属性、线性与范围、精密性、准确性及定量限进行验证。结果 优化后的方法 为采用TSK-gel G2000SW_xl色谱柱(5μm,7.8 mm×300 mm)进行测定,流动相50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.80),检测波长280 nm,进样量100μL,流速0.6 mL/min,柱温45℃。rhGH-Fc免疫融合蛋白与聚合物分离度、理论塔板数、拖尾因子均能满足要求;rhGH-Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致,GH国家标...     

羟基磷灰石分离纯化抗TNF-α单克隆抗体

目的用填料为羟基磷灰石的层析柱纯化抗TNF-α单克隆抗体。方法经protein A为填料的层析柱纯化抗TNF-α单克隆抗体后,通过Do E实验设计,对填料为羟基磷灰石的层析柱的洗脱流速、p H值及盐浓度进行优化,确定最佳洗脱条件后,进行抗TNF-α单克隆抗体的纯化,纯化产物经HPLC及毛细管电泳法检测其浓度、多聚体含量及纯度。结果抗TNF-α单克隆抗体经protein A层析纯化后,回收率达96.1%,纯度为96.0%,多聚体含量下降至1.9%。通过Do E优化,筛选出最佳条件范围为:流速1~3 ml/min,0.25~0.30 mol/L Na Cl,p H 7.0~7.3,选定1 ml/min流速、0.25 mol/L Na Cl、p H 7.0、作为洗脱条件进行纯化,回收率为93.1%,纯度为97.3%,多聚体含量为0,优于参比制剂。结论将羟基磷灰石用于抗TNF-α单克隆抗体的中度纯化,获得符合参比制剂质量的产品。     

无水体系中环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶制备高载量固定化金属亲和层析介质

在以二甲基亚砜为溶剂的无水体系中,利用环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶Sepharose 6 Fast Flow进行活化,并偶联亚氨基二乙酸和Cu2+制备了固定化金属亲和层析介质. 结果表明,该体系中环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高,在40%(j)环氧氯丙烷、0.02 g/mL NaOH及50℃、反应时间4 h的优化条件下,环氧基活化密度最高达165 mmol/mL,较目前报道的最高值提高50%以上. 最终所制介质的Cu2+螯合密度为128.3 mmol/mL,对BSA的平衡吸附容量达2.05 mmol/L. 以0.5 mol/L咪唑为洗脱剂,被吸附的BSA洗脱率可达90%以上.     

固定床中米格列醇的离子交换洗脱规律性研究

为了探讨固定床中米格列醇的洗脱规律,在固定床D001树脂吸附米格列醇量给定下,实验通过洗脱剂种类、浓度和流速来分别考察其对米格列醇的洗脱影响,选择最佳洗脱条件,同时以此洗脱条件考察不同床层高度对米格列醇的洗脱影响。结果表明:氨水与盐酸和氯化钠相比,洗脱平衡时间最短,洗脱率最大,选择氨水为洗脱剂,且当氨水浓度为4 mol/L,流速为0.3 mL/min时米格列醇从固定床上的洗脱效果最好,洗脱率达到99.3%。以此选择的最佳洗脱条件对固定床不同床层高度下米格列醇洗脱率的影响研究结果表明:当床层堆积高度为2.8 cm时洗脱率相对较小,为1.5 cm时的洗脱率相对较大。     

阴离子交换层析法纯化聚唾液酸工艺

以大肠杆菌发酵所产聚唾液酸粗品(含蛋白质、核酸、无机盐和色素等杂质)为纯化对象,通过静态吸附和梯度洗脱实验选择了分离效果较好的阴离子交换介质Q-琼脂糖凝胶FF,对聚唾液酸的纯化工艺条件进行优化. 得到最佳洗脱条件为：洗脱液为pH 7.2的NaCl-0.02 mol/L磷酸钠缓冲液体系,流速0.8 mL/min,洗脱线性梯度方程为CNaCl=0.0017VEluent (CNaCl为NaCl浓度,VEluent为洗脱液体积),层析柱体积46 mL时最大进样量4.0 mL. 该条件下聚唾液酸回收率在86.0%以上,纯化后样品中的蛋白质含量从1.9%降低至0.04%,纯度在98%以上. 紫外吸收光谱和高效凝胶过滤色谱分析表明,聚唾液酸产品组分均一,重均分子量为303 kDa.     

沸石法苦卤提钾工艺研究

以改性斜发沸石为离子交换剂,采用离子交换技术,做了以氯化钠溶液为洗脱剂的苦卤提钾工艺研究。单柱实验表明,洗脱温度越高、洗脱剂浓度越大以及适当流速时有利于钾富集。吸附采用模拟移动床流程,进料顺序为“低段溶液-苦卤”,钾平均吸附率可达95%以上;洗脱采用固定床流程,进料顺序为“高段溶液-中段溶液-低段吸后溶液-25%（质量分数）NaCl溶液”,得到氯化钾平均质量浓度为35.39 g/L的富钾卤水,较苦卤钾浓度提高2.7倍。在钾富集同时,苦卤中的镁、硫酸根等杂质离子亦得到了有效去除,为实现苦卤高效节能提钾奠定了基础。     

十二烷基硫酸钠的临界胶束浓度的测定及影响分析

临界胶束浓度(CMC)是表面活性剂活性的度量。采用电导法测定表面活性剂十二烷基硫酸钠的临界胶束浓度,并探讨了温度、NaCl或乙醇等对临界胶束浓度的影响。随着温度的升高,CMC增大;NaCl的加入量增大时,CMC在较低浓度下增大,在0.2~0.8 mmol/L范围内CMC随NaCl的量增大而降低;乙醇的加入量随体积比从0%~2.5%增大时,CMC增大,并分析了SDS的CMC发生变化的原因。     

一步离子交换层析从Cohn组分V上清液中分离人血清白蛋白

传统的血浆低温乙醇沉淀工艺中Cohn组分V上清液由于其乙醇浓度高(体积浓度40%),进一步回收残余蛋白困难而被作为废弃组分。本研究探索了采用一步层析从Cohn组分V上清中回收人血清白蛋白的方法。首先以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,比较了三种不同类型介质在不同乙醇水溶液中的吸附容量。疏水介质在乙醇水溶液中对BSA吸附能力很弱,增加乙醇浓度导致吸附量趋近于零;阳离子交换介质在低乙醇浓度下有较高的吸附量,但随乙醇体积浓度增高下降较大。相比之下阴离子交换介质展示了最好的吸附性能,在乙醇体积浓度40%的乙醇水溶液中吸附容量仍达34.66 mg/mL。进一步实验表明,在乙醇存在下BSA在阴离子交换介质上的吸附可用Langmuir等温吸附方程描述。将阴离子交换介质DEAE Sepharose Fast Flow装填层析柱,用于从Cohn组分V上清液中分离人血清白蛋白,将40%乙醇的Cohn组分V上清液直接进料阴离子交换层析柱,采用两步洗脱策略,第一步改变pH值由7.0到4.5以洗脱目标产物人血清白蛋白,第二步将氯化钠浓度从0增加到1 mol/L以洗脱紧密结合的部分酸性糖蛋白。SDS-PAGE电泳检测人血清白蛋白纯度为96.35%,得率为43 mg/L Cohn组分V上清液。圆二色谱和荧光光谱检测表明经过离子交换回收的白蛋白二级结构和三级结构与对照的医疗制品无明显差异。活性分析表明回收的白蛋白与配体华法令钠的结合常数与对照的医疗制品的结合常数相似。本研究表明,离子交换层析可用于从含乙醇的溶液中分离蛋白质,一步离子交换层析就可从血浆工业废弃液中回收高纯度的人血清白蛋白。     

离子交换法从硫酸锰溶液中吸附氯的实验研究

选用大孔阴离子树脂对硫酸锰溶液中的氯离子进行了静态和动态的吸附实验研究,结果表明,在pH=6.5～7.0,氯离子含量为1.53 g/L的条件下,树脂对Cl-有良好的吸附性能,氯的交换容量为20.3 mg/g湿树脂,吸附的氯离子可用0.5 mol/L的稀硫酸解吸,解吸率可达97.4%。     

离子交换批量层析纯化重组类人胶原蛋白Ⅱ

对阳离子交换树脂CM52纯化类人胶原蛋白Ⅱ(Hum an-like Collagen B ioprote inⅡ,HCBⅡ)的合适条件进行了研究。通过实验,确定了批量层析的最佳操作条件,即在pH=4.0、NaC l 0.15 mol/L、进料质量浓度7 mg/mL、处理量17.26 mL/g进行吸附,吸附时间为60 m in,然后在pH=4.0、NaC l 0.30 mol/L下进行脱附。实验表明:采用批量层析吸附HCBⅡ后上柱洗脱,树脂CM52对HCBⅡ的吸附量可达到48.6 mg/g,回收率83.8%,最终纯化的HCBⅡ达电泳纯,相对分子质量为97k。     

中华绒螯蟹组织蛋白中变应原组分的分析与提取

目的对中华绒螯蟹组织蛋白中的变应原组分进行分析鉴定和分离提取,为研制蟹类食物过敏反应的检测试剂和脱敏制剂奠定基础。方法中华绒螯蟹粗提蛋白经SDS-PAGE分离,用蟹过敏症患者血清经Westernblot分析其变应原组分。粗提蛋白经硫酸铵分段盐析和DEAE-52离子交换层析,分离提取中华绒螯蟹的主要变应原成分,并用蟹过敏症患者血清对层析产物进行ELISA分析。结果SDS-PAGE分析显示,中华绒螯蟹粗提蛋白有20多条可辨蛋白带,相对分子质量在15700～118000之间。Westernblot分析显示,7份蟹过敏患者血清与粗提蛋白均呈阳性反应,主要有9条反应带,其中相对分子质量为35000、41000、48000和66000的4条蛋白带与7份患者血清均呈阳性反应。经DEAE-52离子交换层析分离后,变应原主要出现在30%盐析段0.2mol/L洗脱峰、50%盐析段0.2和0.4mol/L洗脱峰、70%盐析段0.2和0.3mol/L洗脱峰、90%盐析段0.2mol/L洗脱峰内。结论中华绒螯蟹组织蛋白中的相对分子质量为35000、41000、48000和66000的组分是其主要变应原。     

4种金属离子亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的效果比较

对利用金属离子亲和层析纯化重组类人胶原蛋白过程中使用的金属离子进行了比较,从而对分离纯化的条件进行优化。在相同实验条件下,用4种金属离子柱分离纯化目的蛋白。结果显示,经4种金属离子柱纯化后镍柱的总蛋白收获率最高,铜柱与锌柱居中,钙柱最低;而柱保留时间则为锌柱最高(12.38 m in),钙柱最低(8.25 m in);钙柱洗脱时所需咪唑解离初始浓度最低(100 mmol/L),锌柱最高(200 mmol/L);对SDS-PAGE电泳图进行分析得纯化后类人胶原蛋白的纯度分别为:镍柱82.8%,铜柱83.4%,锌柱96.2%,钙柱94.3%。由此可见锌柱对目标蛋白的亲和力最高,且纯化后类人胶原蛋白的纯度也最高。因此,确定锌离子作为亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的金属离子。