BKR基因启动子鉴定及表达调控

BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌中的一个重要的甾体化合物降解酶基因,Tet R、LysR和LuxR蛋白是睾丸酮丛毛单胞菌中的调控蛋白。以EGFP为报告基因,构建p K-BKR-EGFP质粒,通过与p K-EGFP分别转化到大肠杆菌JM109,检测荧光信号,确定预测的序列中包含BKR基因的启动子。然后通过质粒共转化技术,检测Tet R、LysR和LuxR蛋白与p K-BKR-EGFP的荧光信号强度,探讨Tet R、LysR和LuxR三个蛋白与BKR基因之间的调控关系。实验结果表明:BKR基因的启动子在该基因前699bp内;LysR与BKR基因共转后荧光信号增强;Tet R和LuxR分别与BKR基因共转后荧光信号减弱。由此可以得出结论,LysR对BKR基因的调控起增强作用;Tet R和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用。该实验揭示了睾丸酮丛毛单胞菌中BKR基因的调控序列,为CT菌利用甾体激素作为唯一的碳源及能源机理提供理论基础。     

睾丸酮诱导下的不同菌种中3α-HSD的表达及含量检测

3-羟类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase,3α-HSD)是睾酮丛毛单胞菌分泌的一种类固醇脱氢酶。本实验利用已构建的pET-3α-HSD转化BL21,得到BL21pET-3α-HSD,经IPTG诱导表达提纯3α-HSD蛋白,建立了3α-HSD蛋白标准曲线。应用ELISA方法检测在睾丸酮的诱导下,三种工程菌C.testosterone,Ca3,BL21PET-3 hsd对3α-HSD的表达量,经过对比研究发现,在三种工程菌中,C.testosterone更宜适合作为检测环境中载体类化合物的指示菌种,并且得出3α-HSD是C.testosterone和Ca3在降解载体化合物的关键酶,在检测中可作为目标蛋白。     

环境中甾体激素降解菌的筛选及功能基因的克隆

利用生物技术解决环境中日益增长的甾体类激素污染的环境问题,寻找相关的菌及其关键基因就非常重要。本研究利用含1.6-4.1%NaCl的SIN培养基从大连海港附近所取海水样中筛选能够降解并利用甾体激素作为唯一碳源和能源的微生物。ELISA检测3-羟基类固醇脱氢酶/羰基还原酶(3-HSD/CR)活性。利用PCR技术克隆3,17-羟基类固醇脱氢酶基因,ELISA技术检测该基因的活性。结果表明筛选到的微生物为一种革兰氏阴性菌,命名为H5-1,具有3-HSD/CR活性,对PCR克隆的3,17-羟基类固醇脱氢酶基因经测序比对同源性为99%,ELISA检测初步证实了该基因的活性。该基因的成功克隆为后期转入受体细胞进行目的蛋白的表达、酶活性鉴定及构建甾体激素降解工程菌株等工作奠定基础。     

茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.     

匀强电场和微生物联合修复石油污染土壤的实验研究

对陕北石油污染土壤进行了微生物和外加电场联合修复的实验研究,实验表明,经过54 d的降解,加菌土样在施加电场条件下石油降解率达到91%,比不加电场土样的降解率79%提高12%,并且在降解初期电场促进了菌剂的生物修复作用,到降解后期,促进作用不明显.分析表明,土壤中的直链饱和烃基本被去除.得出适宜的施加电场条件为辐照时间为10 min,电场强度为300 V.m-1,土壤中石油去除率变化与微生物脱氢酶变化趋势基本一致,表明外加电场刺激了微生物脱氢酶的分泌,对石油污染土壤的生物修复具有积极的促进作用.     

嗜水气单胞菌RecA和Gap-2作为内参蛋白的评价

为确定嗜水气单胞菌中可用于Western Blot的适宜内参蛋白,考察了重组酶RecA和3-磷酸甘油醛脱氢酶Gap-2在该菌不同培养阶段及培养条件下的表达稳定性.以嗜水气单胞菌基因组为模板扩增recA和gap-2基因,并对蛋白进行异源表达.利用亲和层析和凝胶过滤层析技术纯化蛋白,制备多克隆抗体.通过Western Blot技术研究了RecA和Gap-2蛋白在嗜水气单胞菌不同培养时间、不同培养温度和培养环境中铁离子浓度差异条件下的表达情况.结果显示,重组表达载体pET-28a-recA和pET-28a-gap-2构建成功,可与His标签融合表达.纯化后得到了纯度较高的RecA和Gap-2,以二者为抗原制备的多克隆抗体效价均达到1:512000.Western Blot结果表明,RecA在细菌生长稳定期表达情况与前期有所差异,而Gap-2蛋白在该菌不同培养时期、温度及铁离子浓度差异的环境中表达较为恒定.研究表明,Gap-2更适合作为嗜水气单胞菌Western Blot检测用内参蛋白.     

透明颤菌血红蛋白基因在恶臭假单胞菌中的克隆及表达

自然界存在一种革兰氏阴性,专性好氧菌透明颤菌1#(Viteroscilla1#),在微氧条件下,可以诱导合成一种类似于血红蛋白的可溶性物质,即透明颤菌血红蛋白(VitereoscillaHemoglbim,VHb)。受体恶臭假单胞菌6-81(Pseudomonas puti-da6-81)具有降解PTA功能。VHb基因在受体6-81中克隆并获得表达。研究了转化子LEY-9与受体6-81在不同供氧条件下对PTA降解率的差异。在供氧条件下,LEY-9对PTA的降解率比6-81高29.6%;在限氧条件下,LEY-9对PTA的降解率比6-81高39%。转化子LEY-9在限氧条件下,对PTA的降解率比在供氧条件下受体6-81,对PTA的降解率高出20.6个百分点。通过将VHb基因克隆入对PTA具有降解功能的受体菌中,可使其在较低的溶解氧环境中,仍具有较高的降解率。对VHb在污水处理系统中的应用作了初步的探索。     

大肠杆菌arpA基因的表达及功能鉴定

E.coli的arpA基因位于异柠檬酸脱氢酶激酶(aceK)基因和异柠檬酸裂解酶调节因子基因(iclR)之间。根据E.coli基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增了arpA基因,并将其克隆入pET-28b(+)。经IPTG诱导,ArpA蛋白可以获得高效表达。通过细菌染色体同源重组技术,构建arpA基因敲除菌株ΔarpA-MG1655。ΔarpA-MG1655在葡萄糖-MOPS培养基中的生长速率和野生型E.coli MG1655的生长速率很接近,前者约是后者的95%。ΔarpA-MG1655在乙酸-MOPS培养基中的生长速率几乎与野生型E.coliMG1655一样,说明ArpA对细菌在乙酸-MOPS培养基中的生长没有明显的影响,对乙酰辅酶A合成酶(Acs)没有明显的调控作用。ArpA包含锚蛋白重复序列,与很多真核生物包含锚蛋白重复序列的蛋白质高度同源,分子系统学分析认为一些在病毒和细菌中发现的锚蛋白重复类似蛋白,可能是进化过程中基因水平迁移的结果。     

干扰MHR1对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响

利用RNA-Seq技术,筛选到潜在的负调控因子MHR1(fungal_TF_MHR1).为研究MHR1与纤维素酶基因表达之间的关联,设计基因mhr1的RNA干扰序列,并使用丙酮酸脱羧酶强启动子pdc成功构建mhr1基因的RNA干扰表达载体,经原生质体转化,获得一株干扰效率较高的阳性转化子MtR5.通过RT-q PCR、酶活测定和胞外蛋白浓度测定等分析发现,在诱导和非诱导培养条件下,转化子MtR5的胞外蛋白浓度、纤维素酶活性以及主要纤维素酶基因的表达量均高于野生型的.干扰转录因子MHR1可增加纤维素酶基因的表达量,研究表明,MHR1是一种与纤维素酶基因表达调控相关的转录因子.     

鼠CCL5蛋白的原核表达与纯化

趋化因子(CCL5)是由正常T细胞分泌的典型的具有趋化活性的细胞因子,分子量8kD,属于CC型趋化因子的β家族成员之一,并调控T淋巴细胞的活性和分泌能力.本研究旨在克隆小鼠趋化因子CCL5基因并在原核表达系统中实现表达,获得与His标签融合的重组趋化因子mCCL5蛋白,并测定其在体外的趋化活性.将趋化因子CCL5基因扩增并插入pET-28a原核表达载体,转化至Rosetta感受态细胞中.重组mCCL5蛋白以IPTG诱导表达,再以Ni-NTA纯化系统进行纯化.Transwell实验检测重组CCL5蛋白的趋化活性.结果显示pET-28a-mCCL5原核表达载体成功构建,mCCL5蛋白在细菌中大量表达并主要以包涵体的形式存在.表达产物以SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,Transwell实验证实趋化因子能够显著促进巨噬细胞RAW264.7细胞的迁移.带有His标签重组鼠趋化因子CCL5的成功表达,为下一步CCL5抑制剂的筛选奠定基础.