应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。     

变性泡介导的链交换扩增反应对副溶血性弧菌检测的研究

以副溶血性弧菌为研究对象,根据其特异性基因GyrB的保守序列,设计了一对扩增引物,利用SEA反应对该基因进行了特异性扩增。研究结果表明:SEA反应对副溶血性弧菌的检测,检测限可达到0.1fmol、特异性高、抗干扰能力强。     

溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)检测体系,对溶藻弧菌进行检测。采用溶藻弧菌的hsp60基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测溶藻弧菌的NASBA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为6.9×102 cfu.mL-1,高于普通PCR方法。溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法具有较高灵敏度和和良好特异性,并且对仪器要求更低,用普通恒温设备即可进行反应,具有广阔的推广前景。     

迟缓爱德华氏菌等温扩增快速检测方法的建立

迟缓爱德华氏菌是一种危害淡水及海水水产动物的致病菌,可感染包括鳗鲡、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼等在内的多种水产鱼类,极易给水产养殖业造成严重的经济损失.现有的迟缓爱德华氏菌检测方法须借助实验室条件才能完成,检测过程较为复杂.建立一种简便的、无需依赖实验室条件即可快速检测迟缓爱德华氏菌的方法,对水产养殖业预警和该病菌引发病害的防治具有重要指导意义和实用价值.针对迟缓爱德华氏菌的基因组设计了特异性引物和探针,建立了重组酶聚合酶扩增与侧向流试纸条(RPA-LFS)相结合的检测方法,评价了该方法的特异性和灵敏度,并使用人工模拟样本进行了方法验证.结果显示,RPA-LFS法在37℃孵育20 min即可完成核酸扩增步骤,整体检测时间不超过40 min,与参试的嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这8种水产和食品中常见的致病菌不发生交叉反应,对迟缓爱德华氏菌培养物的检测限为单次反应1个菌落形成单位(CFU),在富集培养后,可检出1×101 CFU/g人工污染样本中的迟缓爱德华氏菌.该方法具有良好的特异性和灵敏度,不依赖精密仪器,是一种快速、便捷的迟缓爱德华氏菌检测方法,具有良好的应用前景.     

基于二茂铁功能化的石墨烯免标记的电化学生物传感器及核酸扩增技术实现对弧菌dsDNA的灵敏检测

通过使用二茂铁(Fc)功能化的还原氧化石墨烯(RGO)复合材料及核酸扩增技术构建了一个免标记且简易的电化学生物传感器,实现对食源性弧菌的高灵敏度地检测。探索了最佳的实验体条件,在最佳条件下,二茂铁的峰电流信号的改变与目标物的浓度有良好的线性关系,线性范围为10~(-22)～10~(-15) mol·L~(-1),检测限为4.6×10~(-23) mol·L~(-1),该电化学生物传感器在生物分析和临床诊断领域具有潜在的应用价值。     

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测鳗弧菌

以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)toxR基因内366~571 bp之间的基因序列为靶序列,采用PCR法制备对鳗弧菌特异性的地高辛标记DNA探针,探针长度为206 bp。选取2株鳗弧菌和8株与鳗弧菌亲缘关系非常接近的常见水产动物致病弧菌,通过斑点杂交法对制备的探针进行特异性检测,结果显示该探针对鳗弧菌杂交阳性,而与弧菌属的其它8株细菌均无交叉反应。这表明该地高辛标记探针具有很强的特异性,它能够很好地对鳗弧菌感染进行检测。     

水产品中致病性弧菌的分离与鉴定

采用传统分析法和仪器法对438份水产品进行了分离与鉴定。结果检出7种致病性弧菌186株，检出率依次为副溶血性弧菌46．2％，溶藻弧菌28．5％，创伤弧菌11．3％，拟态弧菌5．9％，河弧菌4．8％，费尼斯弧菌2．2％和海鱼弧菌1．1％，未检出霍乱弧菌。不同水产品及其不同部位致病性弧菌的污染情况不同，而且传统分析法与仪器法(AMS)具有不同的检出率。     

PCR-核酸薄膜层析法检测创伤弧菌

采用自行建立和优化的PCR-核酸薄膜层析检测体系,对创伤弧菌(Vibriovulnificus)进行检测。采用创伤弧菌的vvhA基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测创伤弧菌的PCR-核酸薄膜层析检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立起的检测法灵敏度为3.6×102 cfu·mL-1,比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测方法高一个数量级。创伤弧菌的PCR-核酸薄膜层析检测方法具有较高灵敏度和良好特异性,操作简单,检测速度快,同时又保护了操作人员的身体健康,具有广阔的推广前景。     

水产品中致病性弧菌的分离与鉴定

采用传统分析法和仪器法对438份水产品进行了分离与鉴定。结果检出7种致病性弧菌186株,检出率依次为副溶血性弧菌46.2%,溶藻弧菌28.5%,创伤弧菌11.3%,拟态弧菌5.9%,河弧菌4.8%,费尼斯弧菌2.2%和海鱼弧菌1.1%,未检出霍乱弧菌。不同水产品及其不同部位致病性弧菌的污染情况不同,而且传统分析法与仪器法(AMS)具有不同的检出率。     

基于变性泡介导的加速链交换扩增技术在新型冠状病毒核酸检测中的性能分析

运用变性泡介导的加速链交换扩增技术,建立一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的新方法。收集潍坊市第二人民医院检验科1 492例疑似SARS-CoV-2样本,以荧光定量PCR结果为参考,计算ASEA-SARS-CoV-2核酸检测试剂盒检测新型冠状病毒样本结果的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)。结果表明：ASEA可在30 min内完成核酸扩增,检测限为1 000拷贝·mL^-1。敏感性为96.7%,特异性为99.9%。该方法可在30 min内检测SARS-CoV-2,而之前报道的传统qPCR方法需要数小时。建立了一种基于变性泡介导的加速链交换扩增技术检测新型冠状病毒的新方法。     

一种新孢子虫病实时RPA快速检测方法的建立及应用

犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的新孢子虫病严重影响着养牛业的发展,目前对于该疾病尚无有效治疗的药物或疫苗.为了提高对新孢子虫病的诊断及预防,根据犬新孢子虫中特异性保守基因NC-5建立了一种新型实时RPA检测方法;同时进行了特异性以及敏感性试验,并应用该方法对国内养牛场收集的32份临床样品进行了检测.结果表明:所建立的实时RPA检测方法结果准确、操作便捷,仅需25 min即可得到检测结果.在特异性试验中仅有犬新孢子虫发生了特异性扩增,其余对照病原体在检测中均未有扩增结果;在敏感性试验中最低检测限为37拷贝/反应;在32份临床样品试验中有16份阳性样品,与已有检测技术相比,准确率达100％.说明该方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优势,为新孢子虫病的快速检测奠定了基础.     

基于双适体识别化学发光成像技术检测血小板衍生生长因子

以血小板衍生生长因子(PDGF-BB)为研究对象,利用核酸适体与其特异性识别作用,采用辣根过氧化物酶(HRP)作为标记物,催化luminol-H_2O_2化学发光体系,通过化学发光成像技术建立PDGF-BB双适体识别生物传感器,实现对PDGF-BB的高灵敏检测。线性范围是0~10nmol·L~(-1),检测限0.87nmol·L~(-1);且具有良好的选择性,可实现人体血浆等复杂样品中PDGF-BB的特异性检测。     

四环素抗性基因tet(A)荧光RAA检测方法的建立及应用

为了实现快捷、准确检测抗生素抗性基因，提高环境监测与治理能力，建立了一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification, RAA)的四环素抗性基因tet(A)的快速检测方法.该检测方法以tet(A)基因序列保守区为靶序列，设计其RAA引物，筛选并优化RAA引物探针，建立荧光tet(A)-RAA快速检测方法.结果表明，该tet(A)-RAA法在39℃恒温条件下30 min内即可特异性实现对tet(A)基因片段的有效扩增，与无抗性细菌均无交叉反应.且采用该方法对18个环境样品进行检测，阳性率为100%,与qPCR方法检测结果一致.该四环素抗性基因tet(A)的检测方法灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简便，可用于对抗性基因tet(A)的快速检测，也为开发其他抗生素抗性基因快速检测方法提供了参考.     

LAMP技术在食品致病菌检测中的研究进展

环介导的恒温扩增(LAMP)是近年来发展起来的一种新的恒温核酸扩增技术,该技术具有特异性强、敏感性高、反应快、设备简单等特点,已被应用于病原菌诊断、食品致病菌检测等领域的研究。本文重点阐述了近年来国内外学者应用LAMP技术在食品致病菌检测中的研究进展。     

压电型分子印迹传感器对棉酚的检测

为了减小棉酚检测的检测周期,降低检测成本,以分子印迹修的银晶振作为传感器敏感元件,提出了一种新型压电分子印迹传感器.通过对棉酚和其相似物的检测,证实了压电型分子印迹传感器的灵敏性和特异性.结果表明:该传感器的最低检测限为6μg·L~(-1),检测范围为6~16μg·L~(-1)(相关系数R~2=0.999 6),响应时间为15min;在特异性检测中,该传感器对棉酚的响应频率显著高于相似物.     

海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。     

基于ARMS-TaqMan的EGFR基因E21突变检测

基于突变扩增凝滞(ARMS)技术和TaqMan探针检测技术,以肝癌细胞基因组为模板构建EGFR突变型质粒.针对EGFR基因型设计了特异性的ARMS引物,建立了快速定性检测人EGFR基因突变检测模型.结果表明,该方法的EGFR基因E21突变最低检测限达到101 co pies/m L,分辨率达到1％.     

滚环复制放大SPR检测凝血酶

利用滚环复制技术及纳米金生物条码技术进行信号放大,可实现对低浓度凝血酶的高灵敏检测。利用共价结合将凝血酶抗体吸附在芯片表面作为捕获基底,同时构建包括滚环复制及生物条码的放大体系,以纳米金生物条码探针作为信号标记,通过带有凝血酶适体序列及引物序列的DNA进行滚环复制反应,将信号探针与带有大量重复序列的滚环复制的产物相结合,得到负载纳米金探针的长链DNA,利用凝血酶与适体的特异性结合将这个体系与凝血酶结合,放大反应信号,通过表面等离子共振仪对整个放大体系进行在线检测。得到了检测限为1×10~(-16) mol·L-1的高灵敏性,其线性范围从1×10~(-16) mol·L-1到1×10~(-11) mol·L-1,该方法新颖,实现了高灵敏度、高选择性的检测效果。     

层层自组装复合电极用于检测牛奶中三聚氰胺

研制一种新型、简单、低成本的电化学传感方法,用于检测乳品中的三聚氰胺.首先将氧化石墨烯涂到电极上,制备GO/GCE修饰电极;然后利用层层自组装方法,把1,4-二硫苏糖醇(DTT)、金纳米粒子、L-半胱氨酸(L-Cys)组装到修饰电极表面,制备了GO/DTT/AuNPs/L-Cys/GCE复合电极,用来检测三聚氰胺.通过电化学阻抗和循环伏安行为探讨该修饰电极检测三聚氰胺的作用机理,同时优化了实验条件.该复合电极检测范围在1. 0×10~(-7)～1. 0×10~(-3)mol/L内呈良好线性关系,最低检测浓度为1. 0×10~(-8)mol/L.该修饰电极选择性和重现性好,用于牛奶样品中三聚氰胺的检测,回收率为98. 3%～99. 95%,有实际应用价值.     

快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立

为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。