色氨酸酶在大肠杆菌周质中的分泌融合表达

按照大肠杆菌偏爱密码子合成编码“BspTI位点一连接肽（Gly—Ser—Gly—Ser—Gly一6His—Tag—Ek—site（Asp—Asp—Asp-Asp—Lys）”序列的DNA序列,利用重叠延伸拼接技术,将其与色氨酸酶基因TnaA拼接,利用BspTI和HindⅢ重组至pET-39二硫键形成蛋白DsbA基因的下游,转化表达宿主EscherichiacoliBL21（DE3）,成功构建分泌融合表达型色氨酸酶基因工程菌．通过摇瓶培养实验研究了诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间对色氨酸酶活性的影响．工程菌以舍2％甘油的LB为培养基,A600=0．5时,加入终浓度为0．05mmol／L的Isopropyl伊D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）,30℃诱导培养8h,可在周质空间中表达高活性的色氨酸酶融合蛋白．在培养基中添加0．5％的甘氨酸,酶活可提高6．3倍．本实验首次实现了色氨酸酶基因的周质分泌融合表达．     

TRAIL 胞外区编码基因的设计、人工合成及其表达

根据大肠杆菌密码子偏爱性要求, 设计编码TRAIL 胞外段(114 ～ 281 氨基酸)的DNA 序 列, 分段合成拼接引物并连接, 得到目的基因, PCR 扩增后克隆于T 载体中, 经测序证实后, PCR 法在目的基因的5′, 末端引入肠激酶识别位点EKsite 的编码序列, 重组于胞内融合表达型T 载体 中, 构建成pDsbA-6Hi s-EKsi te-TRAI L 胞内融合表达质粒, 重组质粒转化表达宿主E .coli BL21 (DE3).在33 ℃条件下, 添加终浓度为0 .4 mmol/L 的IPTG 诱导表达, 全菌SDS-PAGE 分析结果 表明:所构建的工程菌能表达44 kD 左右的TRAI L 融合蛋白, 与理论值相符.     

杂合抗菌肽MT在大肠杆菌中的融合表达

为了在大肠杆菌中表达杂合抗菌肽Magainin-Thanatin(MT).通过大肠杆菌密码子偏爱性优化两抗菌肽基因序列,SOE-PCR技术构建克隆载体并测序;将其转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中构建基因工程菌,表达产物做抑菌活性分析.结果在本研究中经SOE-PCR拼接后得到了杂合肽片段,成功构建了表达载体pGEX-6P-1-MT;转化后得到了重组菌株pGEX-6P-1-MT/BL21(DE3);获得诱导产物分子质量约3.35kDa;其对大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌等均有抑制作用.这表明杂合肽MT可以在大肠杆菌BL21(DE3)中融合分泌表达且具有抗菌活性.     

重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中融合可溶表达

将N-利用基质(NusA)和人骨形态发生蛋白-2成熟肽(hBMP-2m)的编码基因进行基因融合,实现了hBMP-2m在大肠杆菌中的融合可溶表达.以大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增得到NusA基因,通过NdeⅠ和AflⅡ酶切位点将其置换出重组融合表达载体pDsbA-hBMP-2m中的DsbA基因,使hBMP-2m基因重组于NusA基因的下游,重组质粒转化E.coli BL21(DE3),获得工程菌.在30℃条件下,经IPTG诱导表达后,融合蛋白占细胞总蛋白的45%左右,并且主要以可溶形式存在,可溶部分达90%以上.经过简单的Ni 2+柱一步纯化即可得到纯度较高的融合蛋白.通过融合表达的方式表达出可溶性的目的蛋白,有望复性后通过肠激酶酶切得到hBMP-2m单体,进一步二聚体化得到具有生物活性的hBMP-2m.     

酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达

选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.61提升到0.85。在基因的5'端融合编码α信号肽序列,在3'端融合编码6个组氨酸标签序列,并在N端编码α信号肽和编码成熟酸性β半乳糖苷酶基因间分别引入编码kex2和Ste13裂解信号序列。基因克隆到pPICZα-A表达载体,构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-β-Gal。在醇氧化酶(AOX1)启动子调控下,酸性β-半乳糖苷酶得到高效分泌表达,达到508 mg/L,比优化前提高3倍。重组酸性β-半乳糖苷酶具有天然的酸性β半乳糖苷酶相同的酶活性。     

假单胞菌产弹性蛋白酶基因的克隆与表达

从假单胞菌(Pseudomonas sp.)XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础.以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET30a(+)进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析.实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E.coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20%;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48 000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上.表达蛋白具有良好活性.     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

人胸腺素α1基因工程菌的构建与表达

胸腺素α1(Thymosin alpha 1,Tα1)是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂,临床用途广泛.为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成编码Tα1的基因,克隆于pUCmT,转化E.coli JF1125,经测序证明序列正确后,克隆入pET39(b)的BspT I和BamH I位点,成功地构建出包含信号肽,DsbA,连接肽,6个His,EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),胸腺素α1的表达载体,转化E.coliBL21(DE3),获得胸腺素α1基因工程菌.SDS-PAGE分析表明,经0.1 mmol/L IPTG和30℃诱导8 h,在大肠杆菌周质中大量表达表观分子量31 kD左右的融合蛋白.为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组胸腺素α1创造条件.     

人瘦素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将人瘦素成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,人工合成全基因序列。将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体pPIC9-hLeptin,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达目的蛋白的酵母工程菌。结果表明,成功构建了重组人瘦素毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达重组人瘦素蛋白,表达量高峰出现在诱导96h后,摇瓶表达量为200mg.L-1。