T载体研究进展

T载体是直接克隆或表达PCR产物的新型载体,重组过程无需酶切和纯化,简便高效.在总结国内外研究的基础上,概述了构建T载体的方法,其中内切酶法是T载体制备方法中最先进的方式.阐述了T载体在抗体库构建、目的基因克隆、某些蛋白的融合表达方面的应用以及目前T载体的商业化.对表达型T载体与克隆型T载体进行了比较,其中表达型T载体可以同时满足基因克隆和表达的需要,还具有其他独特的优势.介绍了表达型T载体的构建难点,探讨了今后T载体的研究发展方向.     

HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中的表达

分泌融合表达HIV-1蛋白酶(Protease,PR),用于对HIV蛋白酶抑制剂的筛选.利用重叠延伸PCR方法,获得使用大肠杆菌偏爱密码子的编码HIV-1蛋白酶(PR)的基因,将目的基因重组至原核表达载体pET-SP-DsbA-T,得到"pET-SP-DsbA-PRsite-PR"分泌融合表达型载体,重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3).工程菌在LB培养基中添加终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析周质蛋白.DNA测序结果证实合成的HIV-1 PR基因与设计的序列完全一致,在周质空间表达出具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.研究成功合成并克隆了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,经表达鉴定得到具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.     

大学图书馆读者阅读需求特点及需求变动分析

大学图书馆读者阅读需求有个性化、多样化特点,通过对大学图书馆的读者分层,依次对大学图书馆的本科生、研究生、教师及科研人员的阅读需求变动进行了分析;并根据大学读者阅读需求变化规律以及不同群体读者的阅读需求特点,提出了如何更好地为大学读者提供满意优质服务的对策建议。     

带信号肽DsbA-胸腺素α1融合蛋白的表达及其分离纯化

以构建好的人胸腺素α1基因工程菌为研究材料,研究影响DsbA-胸腺素α1融合蛋白分泌效率的因素,优化信号肽酶表达得到阻遏的培养条件,获得含带信号肽DsbA-胸腺素α1融合蛋白的菌体,破碎细胞后利用疏水层析与Ni2 螯合亲和层析进行目标蛋白分离纯化,获得较高纯度底物蛋白(信号肽DsbA-胸腺素α1融合蛋白,其分子量约为34 kD),为进一步研究及分离纯化DsbA信号肽酶创造条件.     

分泌型人胸腺素α1基因工程菌高密度发酵工艺的研究

探索分泌型重组人胸腺素α1工程菌的高密度高表达发酵工艺.在摇瓶培养获得大肠杆菌分泌型重组人胸腺素α1融合蛋白发酵的最佳条件的基础上,用15 L自控发酵罐进行分批补料培养,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源,保持溶氧在30%以上,OD600约为25的时候,添加0.5 mmol/LIPTG于28℃诱导10 h.最终菌体密度OD600可达40以上,目的产物占菌体总蛋白25%以上.分泌型人胸腺素α1基因工程菌高密度发酵工艺的建立为工业化生产重组人胸腺素α1提供基础.     

TRAIL 胞外区编码基因的设计、人工合成及其表达

根据大肠杆菌密码子偏爱性要求, 设计编码TRAIL 胞外段(114 ～ 281 氨基酸)的DNA 序 列, 分段合成拼接引物并连接, 得到目的基因, PCR 扩增后克隆于T 载体中, 经测序证实后, PCR 法在目的基因的5′, 末端引入肠激酶识别位点EKsite 的编码序列, 重组于胞内融合表达型T 载体 中, 构建成pDsbA-6Hi s-EKsi te-TRAI L 胞内融合表达质粒, 重组质粒转化表达宿主E .coli BL21 (DE3).在33 ℃条件下, 添加终浓度为0 .4 mmol/L 的IPTG 诱导表达, 全菌SDS-PAGE 分析结果 表明:所构建的工程菌能表达44 kD 左右的TRAI L 融合蛋白, 与理论值相符.     

骨形态发生蛋白-7在E.coli中的可溶性表达

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)属于转化生长因子(TGF-β)家族中的成员,有很强的骨诱导作用.为了获得可溶性的rhBMP-7,利用SOE-PCR法获得链球菌G蛋白B1域(GB1)目的基因,构建GB1、连接肽、6His-tag、EKsite (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-7融合表达型载体,转化E.coliBL21 (DE3).工程菌在28℃下经0.1 mmol/LIPTG诱导后,可获得表观分子量约为28 kD的以可溶形式表达的GB1-BMP-7融合蛋白.     

色氨酸酶在大肠杆菌周质中的分泌融合表达

按照大肠杆菌偏爱密码子合成编码“BspTI位点一连接肽（Gly—Ser—Gly—Ser—Gly一6His—Tag—Ek—site（Asp—Asp—Asp-Asp—Lys）”序列的DNA序列,利用重叠延伸拼接技术,将其与色氨酸酶基因TnaA拼接,利用BspTI和HindⅢ重组至pET-39二硫键形成蛋白DsbA基因的下游,转化表达宿主EscherichiacoliBL21（DE3）,成功构建分泌融合表达型色氨酸酶基因工程菌．通过摇瓶培养实验研究了诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间对色氨酸酶活性的影响．工程菌以舍2％甘油的LB为培养基,A600=0．5时,加入终浓度为0．05mmol／L的Isopropyl伊D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）,30℃诱导培养8h,可在周质空间中表达高活性的色氨酸酶融合蛋白．在培养基中添加0．5％的甘氨酸,酶活可提高6．3倍．本实验首次实现了色氨酸酶基因的周质分泌融合表达．     

提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性

以E.coli DH5a基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T栽体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coli BL21(DE3)和E.coli origami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在E.coli origami(DE3)中的可溶蛋白含量比E.coli BL21(DE3)中高.融合蛋白的可溶部分经Ni2+螯合亲和纯化,纯化后E.coli origami(DE3)中蛋白活性比E.coli BL21(DE3)中明显提高,达到1 614.3U/mg蛋白.     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.