大豆PM2蛋白11氨基酸结构域的耐盐功能鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3（late embryogenesis abundant group3）蛋白.以含大豆PM2基因的重组载体为模板,PCR法扩增出可编码6拷贝11-氨基酸重复序列的基因片段PM2D.构建pET28a/PM2D重组载体,并转化大肠杆菌得到重组菌BL21/PM2D.SDS-PAGE电泳结果表明,BL21/PM2D重组菌可被诱导表达相对分子质量约为15 000的蛋白条带,与目的蛋白的理论相对分子质量（13 600）接近.利用DNASIS软件分析,PM2D缺失短肽的亲水指数为1.12.将重组菌BL21/PM2和BL21/PM2D分别涂布在含500 mmol/L NaCl和1 200 mmol/L 山梨糖的固体培养基上,计算重组菌的存活率.结果显示,两种重组菌在含500 mmol/L NaCl培养基上的存活率分别为30.8%和26.0%,均高于对照菌（BL21/pET28a）的存活率;在含1 200 mmol/L山梨糖培养基上的存活率分别为59.7%和59.3%,与对照BL21/pET28a菌株的存活率相比无明显差异.PM2D短肽长度为PM2蛋白全长的1/4,但BL21/PM2D重组菌的耐盐能力为BL21/PM2重组菌的80%左右.表明11-氨基酸重复序列区是PM2蛋白序列的一个耐盐结构域.     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

利用酵母表达体系研究大豆SALI3-2蛋白功能

以含有大豆Sali3-2cDNA的重组载体为模版,扩增出SALI3-2蛋白及其缺失信号肽的SIcDNA片段,构建酵母表达载体pYES2/S、pYES2/SI以及可表达SALI3-2-His6的pYES2/SH.空载体pYES2/ct和重组载体在转化酿酒酵母INVSC1后得到相应的酵母重组子INV/CK(对照菌)、INV/S、INV/SI和INV/SH.Westernblot实验结果表明,SALI3-2蛋白在酵母INVSC1中可被半乳糖诱导表达.对INV/CK、转基因的重组菌INV/S、INV/SI在无胁迫、含1.5mol/LNaCl或山梨醇培养基中的生长情况进行分析.结果表明,大豆SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达对无胁迫条件下酵母的生长没有影响,而在NaCl胁迫下可明显提高酵母转化子的耐盐能力.信号肽的缺失使SALI3-2蛋白的耐盐能力有所下降,可见信号肽对该蛋白耐盐功能的发挥有重要作用.另外,SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达不能提高酵母重组子的抗渗透能力,表明SALI3-2蛋白对细胞不具有明显的渗透胁迫调节作用.     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

拟南芥肌醇- 1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA（AtMIPS1）,开放读码框为1533bp,编码510个氨基酸．与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86％-90％与95％-96％,并含有MIPS基因的保守区域“334SYNHLGNNDG”．将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a（＋）原核表达载体上,SDS—PAGE结果表明：在0．12g／LIPTG诱导2h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础．     

大豆耐盐相关基因的分离及其功能鉴定

利用大肠杆菌功能表达体系,从大豆开花40d未成熟种子的cDNA表达文库中筛选获得了11个耐盐相关cDNA克隆.对其中3个克隆的插入片段进行测序.结果显示,其中的Gm1013为一尚未报道的新基因片段;GmRPS25 2编码的蛋白质序列与西红柿40S核糖体蛋白S25有91%的同源性;GmAIP 2编码的蛋白质序列与大豆根铝诱导蛋白SALI3 2有97%的同源性.其中GmAIP 2可表达分子量为30 8kD的多肽.pET GmAIP 2转化后的大肠杆菌在含800mmol/LNaCl和700mmol/LKCl的液体培养基中生长状况明显好于对照菌,即前者表现出较短的生长迟滞期和较高的生长量.     

籼型杂交水稻保持系IR58025B pin2转基因植株

杂交水稻技术在中国及其他国家已作为发展水稻生产,满足不断增加的人口对粮食需要的一条关键途径．而另一方面,据估计因螟虫危害造成水稻年均损失为5％～10％,有时高达60％～95％．应用马铃薯蛋白酶抑制剂基因(potato proteinase inhibitor Ⅱor pin2)进行粳稻的遗传转化实验表明,其转基因粳稻植株对螟虫的抗性显著提高,且该转基因能在后代中稳定遗传(Duan et al．,1996)．为了改良杂交水稻对螟虫的抗性,以大面积应用的籼型杂交稻保持系IR58025B成熟胚为外植体材料、以pin为目的基因、通过基因枪法高效获得了大量转基因植株．PCR检测结果表明转基因pin2成功地整合于植株基因组中．三化螟幼虫饲喂试验结果初步证实了该转基因在转基因当代植株中的表达．     

耐盐脱毛蛋白酶产生菌的研究：Ⅱ耐盐菌产酶条件的研究

通过碳源、氮源实验以及碳氮配比实验研究，得到了耐盐菌适宜的产酶发酵培养基，培养基起始ｐＨ为７．０，接种菌龄１２小时种子液２％为宜。培养温度摄氏３０－３８度，培养时间４８－６０小时。该耐盐菌产酶可稳定在４１００－４４００ｕ／ｍｌ（培养液）。     

不同条件下耐盐脱氮复合菌剂的脱氮特性

目的研究人工构建的高效耐盐脱氮复合菌剂在不同条件下的生长情况和脱氮效果,为优化培养条件、提高高盐废水的脱氮效率和处理实际废水提供运行参数．方法在转速125r／min的恒温振荡培养箱中,按6％接种复合菌剂,控制初始氨氮质量浓度100mg／L,进行36h静态脱氮试验．结果耐盐脱氮复合菌剂的脱氮最适m（C）：m（N）为15,最适氯化钠质量分数为3％,pH为7,温度为30℃．耐盐脱氮复合菌剂在氯化钠质量分数为3％～7％均能获得良好的生长和脱氮性能,脱氮率达到99．02％,反应末氨氮质量浓度低于1mg/L．结论耐盐脱氮复合菌剂具有一定耐盐性,脱氮过程中无硝态氮和亚硝态氮积累,可实现同步硝化反硝化,能提高高盐废水生物处理脱氮效率．     

处理低温污水耐冷菌生物膜的研究

寒冷地区冬季生活污水生物处理效率低，处理后污水排放经常出现不达标的问题．为了提高低温生活污水的生物处理效率，采用孔隙结构发达的软性聚氨酯泡沫为固定化载体，对活性污泥中分离得到的高效耐冷菌群进行固定化，并投加到生物反应器中运行．污水处理系统运行到30d左右时，化学需氧量（COD）的去除率达到82％，生化需氧量（BOD）的去除率达到92％．耐冷菌在载体的多孔结构中形成直径10-30μm的成团簇状分布的生物膜，每克载体附着生物量平均可达800mg左右，位于载体外层空间的生物膜量和生物活性明显高于内层．生物膜中耐冷细菌种群呈多样性分布，主要为各种耐冷球菌和杆菌，少量丝状菌起着生物膜骨架作用．低温生物膜的这些微生物结构为稳定系统、高效处理低温污水提供了基础．     

非生物胁迫因子对大豆Sali3-2基因的调控作用

通过生物信息学方法对Sali3-2基因上游非编码区序列(-1 945/+1)中的顺式作用元件进行预测.发现该序列中存在铜响应元件、干旱胁迫响应元件及与低温等非生物胁迫相关元件等.在不同非生物胁迫条件下,分别对转基因烟草悬浮细胞和转基因拟南芥幼苗中Sali3-2启动子片段驱动报告基因β-葡萄糖苷酸酶( β-glucuronidase,Gus)的表达进行分析.结果表明,在转基因烟草细胞和拟南芥幼苗中,Gus基因的表达明显受Al3+胁迫的诱导和Cu2+过多的抑制;在转基因烟草细胞中,该基因的表达一定程度上受脱落酸、渗透胁迫和盐胁迫的诱导,研究结果为了解Sali3-2基因的功能及调控作用奠定了基础.     

反胶束溶液同时萃取油和蛋白质的工艺研究

对AOT/异辛烷体系同时萃取大豆中的油和蛋白质进行了研究.实验结果表明蛋白质的萃取率受萃取时间、水溶液的pH值、盐浓度、AOT浓度的影响,与传统制油工艺比较,油的萃取效果基本不变.正交实验分析表明,前萃的最佳条件为萃取时间90min,盐浓度0.1mol/L,pH值5.0,AOT浓度6g/50ml异辛烷.     

Potential of Novel Halotolerant and Psychrotrophic Strain of Planococcus sp. for Water Treatment

一株新耐盐耐低温菌的鉴定及其在废水处理中的应用

王 凯^1,2,李斯琪¹,程喜全¹,张瑛洁¹,闫培生¹,马 军²

（1. 哈尔滨工业大学 海洋科学与技术学院,威海 264209,山东;

2. 哈尔滨工业大学 市政与环境工程学院,哈尔滨 150090）

创新点说明：

发现一株新菌,耐盐耐低温,既具有絮凝能力又可降解COD,其应用范围更广且功能更加多样,以期抵抗复杂多变的实际环境。

研究目的：

筛选出一株耐受盐度、温度范围更广范的多功能型水处理功能菌,以期为淡水或海水净化技术提供一种选择。

研究方法：

从山东威海金海湾排污口分离出一株橘黄色细菌,该菌株可用于处理无盐条件下的模拟废水（COD浓度分别为400和800 mg/L）和高盐条件下的模拟废水（COD分别为400和800 mg/L）,并且探究该菌株在不同温度下处理以上四种模拟废水的能力。通过搅拌器确定了该菌株为絮凝剂产生菌,并通过一系列单因素实验确定了最佳絮凝条件及絮凝剂的分布。

结果：

1)该菌株S2A15在与模式菌株Planococcus maritimus DSM 17275 的相似度达98.8%。

2)该菌株S2A15在盐度为0-12%的条件下生长良好。

3)该菌株S2A15可在4℃-28℃的条件下生长。

4)从温度看,S2A15在28℃时COD降解能力最高;从处理废水浓度看,S2A15处理400 mg/L COD废水时几乎优于处理800 mg/L COD废水;从含盐度看,S2A15在无盐的条件下对COD的降解率几乎优于含盐废水。该菌株S2A15在28 ℃,400 mg/L COD的含盐模拟废水降解COD的效果最好,达到76.90%。

5)最佳的絮凝条件为：3 mL的10%氯化钙,2 mL的絮凝剂,pH为9,处理浓度为1 mg/L的高岭土悬液,其絮凝率能达到90%以上。

6)微生物絮凝剂主要分布在发酵液中。

结论：

1)经鉴定该菌株S2A15为动性球菌属。

2)菌株S2A15为耐盐且耐低温菌株。

3)在常温或低温,含盐或无盐条件下,菌株S2A15均有降解COD的能力。

4)该微生物絮凝是由菌株S2A15产生并分泌到细胞外具有絮凝活性的代谢产物,并且具有热稳定性。

关键词：

COD;絮凝;废水处理;动性球菌属;耐盐菌株

     

60Co-γ射线辐照对转pprI基因烟草抗氧化酶活性的影响

以转pprI基因烟草植株为材料,并以同步培育的非转基因烟草植株为对照,研究了60Co-γ射线辐照对转pprI基因烟草抗氧化酶活性的影响。结果表明,经500 Gy60Co-γ辐照后,转基因和非转基因烟草的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）3种抗氧酶活性以及可溶性蛋白质含量在开始时（0~12 h）都逐渐提高,其中POD的活性则在6 h后达最大值,而SOD和CAT活性在12 h后达到最大值,随后三者活性都逐渐降低。但在500 Gy60Co-γ辐射后相同的时间内,转基因烟草的3种抗氧化酶活性和可溶性蛋白质含量均比非转基因烟草高,SOD、POD、CAT和可溶性蛋白质含量的峰值分别是非转基因烟草峰值的1.1290、1.9690、1.5840和1.9521倍,表明pprI基因提高了烟草在500 Gy60Co-γ辐照下SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性水平,从而提高了转基因烟草对辐射的耐受能力。     

蛋白酶提高大豆原材料利用率作用原理的探讨及其在豆乳工艺中的应用

本文研究了大豆不溶性残渣在蛋白酶作用下蛋白质及碳水化合物的溶出动力学、溶出产物的分子量分布、羟脯氨酸分布、氨基酸组成以及残渣的超微结构等。研究结果表明:蛋白质及碳水化合物的溶出过程可用酶反应动力学方程来描述;溶出产物中含有大量羟脯氨酸,这是细胞壁部分分解的证据;溶出蛋白质分为分子量大于25000和分子量在10000左右来源于细胞壁的两部分。超微结构及溶出产物的氨基酸组成的研究等均表明:蛋白酶分解了细胞组织中及残存在组织中的不溶性蛋白质,使之转化为可溶性物质,这样就增加了蛋白质的萃取率,提高了原材料的利用率。根据这一原理,在豆乳工艺中使用蛋白酶,不仅简化了工艺,而且提高了蛋白质的利用率(82%)。     

鲁梅克斯叶蛋白的加工与利用

鲁梅克斯ｋ － １ 酸模,是以鲜叶为主的新型高蛋白植物,单位蛋白产量为大豆的５倍。鲁梅克斯叶蛋白,又称为核酮糖双磷酸羧化酶,在绿叶中主要起酶促转化二氧化碳进行光合碳水化合物的作用,为酶活性蛋白质。鲁梅克斯叶蛋白的极性氨基酸分布在蛋白体外,使叶蛋白天然就具有良好的溶解特性。以ｐＨ３ 值制得的叶蛋白与４０ ％ 玉米油乳化,在质量分数为４ ％ 时,乳化能力为大豆分离蛋白的９ 倍,发泡能力和泡沫稳定性不仅高于大豆,也远大于鸡蛋蛋白。叶蛋白的必需氨基酸含量符合ＦＡＯ／ ＷＨＯ 按人体需要规定的模式值,为高营养全价蛋白。     

酶促水解对大豆蛋白热凝结性的影响

酶促水解可以显著提高大豆分离蛋白的热凝结性。本课题采用微生物蛋白酶部分水解方法，使大豆分离蛋白的热凝结度从９．３％增加到３５．６％，酸性溶液中的氮溶解率从５．７％增加到４８．１％。拓宽了大豆分离蛋白的应用范围。