坛紫菜5.8S rDNA和ITS区片段的序列分析及应用

对坛紫菜(Porphyra haitanensis)野生(GL)和栽培(PXV)品系的5.8S rDNA-ITS兀区进行了PCR扩增和序列分析,扩增的GL和PXV的DNA片段长度分别为1213 bp和1221bp,包含完整的ITS1-5.8S-ITS2区.然后对紫菜7个种9个品系(其中6种7个品系从GenBank数据库中获得)的rDNA相应序列进行了排序和系统进化分析,结果表明:9个紫菜品系rDNA中5.8S区的长度和序列非常保守,而ITS区的长度和序列则变异较大;根据它们的序列差异,计算出这9个紫菜品系的遗传距离在0.010～0.551之间,遗传相似性在44.9%～99%之间;并且采用邻接法构建了这9个紫菜品系的系统发育树,发现可以明显分为4个进化枝,由此讨论了分子分类方法同传统分类方法的分歧.实验结果表明,5.8S rDNA.ITS区序列可以成为紫菜种质鉴定和系统进化研究的强有力工具.     

牙鲆与大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌生物学特性及系统发育学分析

对从7起牙鲆（Bastard halibut,Paralichthys olivaeeus L．）、3起大菱鲆（Turbot,Scophdudmus maximus L．）病害的病（死）鱼中分离到的相应病原菌较系统地进行了形态特征、理化特性等表观分类学指征的鉴定及代表菌株DNA中G＋Cmol％的测定。同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树。结果表明,分离鉴定的148株菌均为爱德华氏菌属（Edwardsiella Ewing and McWhorter 1965）的迟钝爱德华氏菌（E．tarda）,其中128株为迟钝爱德华氏菌野生型（E．tarda wild type）菌株,20株暂定为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株。代表菌株（HC010907—1及HC010830-1）的16SrRNA基因序列,与GenBank数据库中的迟钝爱德华氏菌的同源性均在99％。     

青岛和大连海区海带(Laminaria japonica)外生细菌的16S rRNA基因序列分析

从采集自青岛和大连的大型褐藻海带(Laminaria japonica)表面分离到22株革兰氏阴性海洋细菌。根据16SrRNA基因序列分析结果,将其分别鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas,Cobetia)菌,嗜冷单胞菌(Psychromonas),交替单胞菌(Alteromonas),产碱杆菌(Alcaligens)和海杆菌(Marinobacter)。其中假交替单胞菌在两地样品中占据绝对优势,但每个产地的假交替单胞菌不能单独聚类在一起,不同海区的海带表面存在遗传关系非常接近的菌株。假交替单胞菌之外的其他菌株于两地样品之间存在种或属水平上的差异。本文结果提示外生细菌的种类既与环境相关,又受宿主的状况影响。对8株受试菌株的拮抗实验结果显示了外生细菌在寻找新型抗生素方面的潜力。     

节旋藻FACHB341 Rubisco基因部分序列的克隆和分析

以节旋藻FACHB34l为材料，对所克隆Rubisco基因进行了核苷酸序列测定和分析，由此推导出相应的氨基酸序列，并与部分其他蓝藻的同源基因进行了同源性分析。结果表明：所克隆DNA片段包含Rubisco大小亚基基因部分序列及rbcX基因序列，长度为2073bp，其中rbcL和rbcX基因之间存在两个转录茎环结构；大小亚基酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例分别为13．14％和14．51％，疏水氨基酸的比例为42．16％；rbcL核苷酸序列与集胞藻PCC6803、Prochlorothrix hallandica、聚球藻PCC630l、Agmenellum quadruplicatum和鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性分别为91．7％、79．9％、74．8％、77．2％和76．1％；rbcS核苷酸序列与鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性为67．6％，而与PCC630l和集胞藻PCC7002同源序列的相似性分别为30．1％和63．8％。     

一株牙Ping出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙Ping分离到一株病原菌M4,革兰氏阴性,杆状,有极生和侧生鞭毛,能运动,菌落半透明。进行了常规生理生化和BIOLOG－GN细菌鉴定系统测试。结果表明菌株M4与V.carchariae的表型特征非常相似。为了进一步确定M4的分类学地位,测定了其16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,结果表明菌株M4和V.carchariae的亲缘关系最近。综合上述结果,菌株M4可鉴定为Vibiro carchariae。     

16SrRNA基因测序确定根瘤菌的系统发育

采用聚合酶链反应和ＤＮＡ测序技术分析了两个新根瘤菌群的代表菌株的部分１６ＳｒＲＮＡ基因序列，并对所得序列进行了聚类分析。在系统发育树状图中，菌株ｓｈ２２６２３所代表的根瘤菌群与菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌及发根土壤杆菌等构成一个亚群，另一个菌群的代表菌株ｓｈ１９３１２与土壤杆菌的３个种构成一亚群。这些结果初步确定了两菌群的系统发育地位，并提示了根瘤与土壤杆菌两属间进化上的密切关系。     

近江牡蛎16S rRNA基因片段序列变异分析

采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了近江牡蛎Crassostrea rivularis(Gould)线粒体DNA16S rRNA基因,获得了大约为500bp的片段。PCR产物纯化后进行序列测定,经Clustal X同源排序,去除引物及部分端部序列,得到了415bp的核苷酸片段。比较并分析了该片段的钦洲湾、长沙湾、镇海湾和珠江口共105个近江牡蛎个体的核苷酸序列多态性,共检测到23个多态性核苷酸突变位点,包括16个转换位点和7个颠换位点,发现了1个核苷酸插入突变位点。4个群体可分为12种单倍型。结果表明：4个群体中广西钦洲湾群体遗传多样性最高,其次为长沙湾、珠江口群体,镇海湾群体最低。     

海带栽培品系和长海带ITS区的PCR扩增及序列分析

对遗传背景清晰且具有显著表型差异的海带6个栽培品系(CUL002,CUL860,CUL1170,CUE017,CUE018,CUL901)和长海带(L．longissia)的ITS区进行了PCR扩增和序列测定,并分析了8个种17个品系(其中7种共10株从GenBank中获得)海带之间的系统进化关系。结果表明：表型各异的6个海带栽培品系ITS区差别很小,其中ITS1 5．8S rDNA序列完全相同,部分品系间ITS2序列有个别碱基差异;进化树显示与日本海带(L．japonica,AF319018)聚在一起,相似性大于98％,其中CUL901、CUL860和CULll70的ITS序列完全相同。长海带(L．longissia)的ITS 5．8S rDNA和日本海带(L．japonica,AF319018)的完全相同。以Undaria peterseniana为外类群,根据ITS 5．8S rDNA序列构建进化树,6栽培品系及长海带与日本海带聚在一起;17株海带基本构成两个大的进化枝。研究结果揭示了我国海域栽培的长海带可能与日本海带(L．iaponica,AF319018)为同一个种。     

山东潮问带刚毛藻DNA条形码鉴定技术

DNA条形码在分类鉴定方面较有效的技术。因此,我们将山东潮间带和福建莆田潮间带地区采集的22株刚毛藻目样品在形态分类的基础上采用18S、ITS和LSU三个基因进行鉴定。结果表明,ITS基因是鉴定刚毛藻目形态相似物种的有效分子标记,而LSU和18s基因对属和属以上水平的物种鉴定较为有效。此外,我们通过形态和分子鉴定结合,共鉴定出9个物种,分别是气生硬毛藻、线性硬毛藻、强壮硬毛藻、辽东硬毛藻、短节硬毛藻、扇形刚毛藻、沙生刚毛藻、苍白刚毛藻、小枝刚毛藻、岸生根枝藻。     

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(Amnrt P)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等.结果表明:该基因全长为1515 个核苷酸,编码 504 个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%.该硝酸盐转运蛋白含有 12 个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与 NRT2 家族的类似,并发现了多个 NRT2 家族的保守序列.同源性搜索显示与属于 NRT2 基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%.采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明 3 种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致.所获 Amnrt P 基因属于 NRT2 基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础.     

北极耐冷假交替单胞菌的培养温度对其胞外蛋白酶合成的影响

从北极楚科奇海水中分离筛选到2株产蛋白酶耐冷细菌BSw20308及BSw20353.经分子鉴定为假交替单胞菌属.这2株菌虽存在较近亲缘关系,16S rDNA序列相似性为98%,但属于不同种,表型方面也存在差异.酶谱分析显示,此2株菌的胞外产物中存在至少3种蛋白水解活性组分.培养温度的变化对这2株菌胞外蛋白水解活性组分的生成具有不同的影响效果,表明极地海洋细菌可能在酶学水平上通过酶的种类与活力的调整和采取不同的策略来适应环境温度的变化.     

一株新硫醇脱臭菌的降解机能研究

从多菌源经富集分离出一株高效降解硫醇臭气的菌株(JLL),通过16S rRNA基因序列分析法和传统的生理生化法相结合,鉴定JLL为黄杆菌属的新种。经洗涤法降解实验分析JLL对硫醇气体的降解机理,并对JLL采用碱裂解法未提出质粒,基本可以确定菌株JLL不含质粒,其降解基因在染色体上,降解过程为染色体控制。     

Specific multiplex analysis of pathogens using a direct 16S rRNA hybridization in microarray system

For the rapid multiplex analysis of pathogens, 16S rRNAs from cell lysates were directly applied onto a DNA microarray at room temperature (RT) for RNA-DNA hybridization. To eliminate the labeling step, seven fluorescent-labeled detector probes were cohybridized with 16S rRNA targets and adjacent specific capture probes. We found that eight pathogens were successfully discriminated by the 16S rRNA-based direct method, which showed greater specificity than the polymerase chain reaction (PCR)-labeled method due to chaperone and distance effects. A new specificity criterion for a perfect match between RNA and DNA was suggested to be 21-41% dissimilarity using correlation analysis between the mismatch and the sequence according to the guanine-cytosine (GC) percentage or the distribution of mismatches. Six categories of food matrix (egg, meat, milk, rice, vegetable, and mixed) were also tested, and the target pathogen was successfully discriminated within statistically significant levels. Finally, we found that the intrinsic abundance of 16S rRNA molecules successfully substituted PCR-based amplification with a low limit of detection of 10-10(3) cells mL(-1) and a high quantitative linear correlation. Collectively, our suggested 16S rRNA-based direct method enables the highly sensitive, specific, and quantitative analysis of selected pathogens at RT within 2 h, even in food samples.     

Species-specific identification of mycobacterial 16S rRNA PCR amplicons using smart probes

Due to growing problems with new emerging pathogens, cost-effective and manageable methods for their accurate identification in routine diagnostics are urgently required. Of particular importance is the genus Mycobacterium with its more than 100 species. Identification of these species is hampered by their slow growth in the laboratory and by the obligate need for DNA sequence analysis. To provide a fast and reliable diagnostic tool, we developed a novel approach using fluorescently labeled DNA hairpin structures (smart probes) for selective and sensitive detection of mycobacterial 16S rDNA PCR amplicons in homogeneous and heterogeneous assays. Smart probes are singly labeled hairpin-shaped oligonucleotides bearing a fluorescent dye at the 5'-end, which is quenched by guanosine residues in the complementary stem. Upon hybridization to target sequences, a conformational change occurs reflected in an increase in fluorescence intensity. Using optimized parameters for hybridization experiments we established a reliable method for the specific detection of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis complex) and Mycobacterium xenopi (member of the atypical mycobacteria) with a detection sensitivity of approximately 2 x 10(-8) M in homogeneous solution. The specificity of the smart probes designed is demonstrated by discrimination of M. tuberculosis and M. xenopi against 15 of the most frequently isolated mycobacterial species in a single assay. In combination with a microsphere-based heterogeneous assay format, the technique opens new avenues for the detection of pathogen-specific DNA sequences with hitherto unsurpassed sensitivity.     

三个根瘤菌新亚群的16S rDNA-RFLP分析

在对新疆，内蒙干旱地区采集的４８株苜蓿，草木樨，锦鸡儿根瘤菌进行数值分类和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ全细胞蛋白分析的基础上。